張麗曼

(石家莊市中醫(yī)院腦病科，河北 石家莊 050051)

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是由于大腦動脈堵塞或狹窄導(dǎo)致腦部供血不足，局部腦組織缺血缺氧引起軟化或壞死，導(dǎo)致神經(jīng)控制區(qū)功能障礙的一種疾病，臨床可出現(xiàn)肢體運動障礙、言語障礙、情感障礙和吞咽障礙等一系列功能障礙[1]。AIS具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高經(jīng)濟負擔(dān)五大特點，是我國成年人致死、致殘的主要原因[2-3]。腦卒中急性期的治療是腦血管疾病治療的核心，其中以靜脈溶栓治療及血管取栓治療為最有效的恢復(fù)腦再灌注的方法[4]。但由于溶栓時間窗以及溶栓風(fēng)險等原因，我國大多數(shù)腦卒中患者沒有機會靜脈溶栓[5]。因此，需要研究臨床適應(yīng)性更好、療效更好的療法。AIS屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)藥防治腦卒中歷史悠久，一項橫斷面研究結(jié)果表明，83.1%的患者在發(fā)病時使用中藥治療，約1/3的患者出院后仍采用中藥治療[6]。柴胡加龍骨牡蠣湯為《傷寒論》中的經(jīng)典方，國內(nèi)學(xué)者在臨床中應(yīng)用其治療腦卒中取得了較好的臨床療效[7]。該方具有和解清熱、鎮(zhèn)驚安神之效，其中柴胡透泄少陽、疏泄氣機，桂枝溫通血脈、通陽復(fù)脈，柴胡散中有升，桂枝升中有降，二者合而為用，共為君藥。君藥針對主病或主證起主要治療作用[8]。因此，本研究以柴胡-桂枝作為研究對象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法挖掘并初步驗證柴胡-桂枝治療急性腦梗死的機制，為進一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 柴胡-桂枝活性成分及作用靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmsp-e.com)檢索“柴胡、桂枝”的主要成分，并以類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%為條件篩選藥物的活性成分及其對應(yīng)的靶點[9]。將靶點信息錄入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)進行標(biāo)準化處理，轉(zhuǎn)換成人源性標(biāo)準基因名。

1.2 AIS疾病基因的獲取

以“Acute Ischemic Stroke”為檢索詞，通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://omim.org)和人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(https://www.genecards.org)進行檢索，剔除重復(fù)基因后得到AIS疾病相關(guān)基因。將柴胡-桂枝作用靶點基因與AIS疾病基因取交集，并繪制維恩圖。

1.3 “活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

利用Excel軟件整理活性成分-靶點信息，建立柴胡-桂枝“活性成分-疾病靶點”數(shù)據(jù)庫，借助Cytoscape 3.8.2軟件制作“活性成分-疾病靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

將“1.2”中得到的藥物疾病共同基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org)獲取PPI信息，并制作PPI圖。導(dǎo)出TSV文件，采用Cytoscape 3.8.2軟件中的“Analyze Network”拓撲功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析。

1.5 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

采用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org)對藥物疾病共同基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，并生成可視化圖。其中GO功能富集分析從細胞組分、分子功能及生物學(xué)過程3個方面對靶點進行作用機制分析，KEGG通路富集分析是對靶點所參與的信號通路進行分析。

1.6 分子對接技術(shù)

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載藥物活性成分的2D結(jié)構(gòu)，借助ChemBio 3D軟件進行能量優(yōu)化，并轉(zhuǎn)化成“mol2”格式的3D結(jié)構(gòu)文件；通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載“pdb”格式的靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)文件，然后利用 PyMOL軟件進行去水、去磷酸根等處理。借助AutoDock Tools-1.5.6將藥物小分子和蛋白大分子統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“pdbqt”格式文件，設(shè)置活性口袋并進行對接。得到的“pdbqt”格式對接結(jié)果經(jīng)Open Babel軟件轉(zhuǎn)換為“pdb”格式文件，然后利用PyMol軟件繪制可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-桂枝藥物活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出柴胡-桂枝24個成分，其中柴胡17個，桂枝7個。藥物成分作用靶點去重后經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成人源標(biāo)準基因，得到203個基因。

2.2 AIS疾病基因的獲取

以“Acute Ischemic Stroke”為檢索詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出相關(guān)疾病基因179個，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索出相關(guān)疾病3 049個。去除2個數(shù)據(jù)庫中的重復(fù)基因后共得到3 197個疾病基因。與柴胡-桂枝203個靶點基因比對，共得到150個交集基因，見圖1。

圖1 柴胡-桂枝治療AIS靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-桂枝藥物活性成分、交集基因錄入Cytoscape 3.8.2軟件，生成“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖2中，圓形部分為藥物疾病交集基因，三角形部分為柴胡-桂枝作用于AIS的活性成分。共得到19個與治療AIS有關(guān)的活性成分對應(yīng)150個藥物疾病共同靶點基因，其中13個來自柴胡，6個來自桂枝。槲皮素(quercetin)對應(yīng)113個靶點，山柰酚(kaempferol)對應(yīng)44個靶點，因此認為槲皮素、山柰酚為柴胡-桂枝治療AIS的關(guān)鍵成分。

圖2 柴胡-桂枝“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點分析

將上述150個共同基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進分析，共同基因產(chǎn)生2 683條相互作用關(guān)系，平均度值(Degree)為35.8。應(yīng)用STRING平臺生成PPI關(guān)系網(wǎng)，導(dǎo)出TSV文件采用Cytoscape 3.8.2 進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析并生成可視化網(wǎng)絡(luò)圖，選擇Degree由大至小排序居前20位的靶點，其中關(guān)鍵靶點有AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等，見圖3—4。

圖3 柴胡-桂枝治療AIS潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 柴胡-桂枝治療AIS的核心基因

2.5 GO功能富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對柴胡-桂枝治療AIS的150個關(guān)鍵靶點從細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程3個方面進行GO功能富集分析，選取P值由大至小排序居前20位的靶點。結(jié)果顯示，柴胡-桂枝有效成分主要通過薄膜筏、囊泡腔、樹突、細胞質(zhì)核周區(qū)、膜側(cè)和突觸后膜等細胞組分參與對無機物的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、活性氧類代謝、對傷害的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路和循環(huán)系統(tǒng)過程等生物學(xué)過程，發(fā)揮蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和細胞因子受體結(jié)合等分子功能，從而起到治療AIS的作用，見圖5。

A.細胞組分；B.分子功能；C.生物學(xué)過程

2.6 KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對150個靶點基因進行KEGG通路富集分析，得到186條通路，選取P值由大至小排序居前20位的通路，主要涉及癌癥信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路和NF-κB信號通路等通路，見圖6。采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“成分-靶點-通路”，并生成個可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。圖7中，六邊形節(jié)點代表藥物活性成分，圓形節(jié)點代表作用靶點，三角形節(jié)點代表信號通路，可以看出，柴胡-桂枝的多個活性成分作用于多個靶點、參與不同的信號通路，體現(xiàn)了多成分、多靶點和多通路的作用特點。

圖6 KEGG通路富集氣泡圖

圖7 柴胡-桂枝“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對接技術(shù)

通過“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)可知，槲皮素、山柰酚是柴胡-桂枝治療AIS的關(guān)鍵成分。由PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等靶點是柴胡-桂枝治療AIS的關(guān)鍵靶點。利用Auto Dock軟件將槲皮素和山柰酚與相應(yīng)關(guān)鍵靶點進行對接，通過結(jié)合能評估對接結(jié)果，見表1。一般認為結(jié)合能<-17.79 kJ/mol提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，<-20.93 kJ/mol提示有較好的結(jié)合活性，<-29.30 kJ/mol提示有強烈的結(jié)合活性[10]。由表1可見，槲皮素與TNF的結(jié)合性最好。以槲皮素為例，借助PyMol軟件將結(jié)合能(≤-20.93 kJ/mol)的對接結(jié)果可視化，見圖8。

A.AKT1；B.CASP3；C.TNF；D.IL-6；E.TP53；F.VEGFA

表1 分子對接結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中的病因病機較為復(fù)雜，涉及神經(jīng)炎癥、能量衰竭、細胞凋亡及自噬等，并且各環(huán)節(jié)相互影響、重疊發(fā)生，更導(dǎo)致了其過程的復(fù)雜性[11]。中醫(yī)學(xué)防治腦卒中具有悠久歷史，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用中醫(yī)藥治療能更好地改善患者神經(jīng)功能缺損情況[3]。其中，柴胡加龍骨牡蠣湯作為《傷寒論》中的經(jīng)典名方，被廣泛用于腦血管疾病的治療[7，12-13]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對該方中君藥柴胡-桂枝藥對進行分析，對藥物的內(nèi)在機制進行更深的理解[14]。

本研究以柴胡-桂枝為研究對象，初步探討其對AIS的作用機制。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以DL≥0.18和OB≥30%作為條件得到柴胡-桂枝有效成分24個。通過Cytoscape生成的“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選出治療AIS的19個活性成分，按照其所對應(yīng)的疾病靶點統(tǒng)計，其中槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素和豆甾醇等成分對應(yīng)靶點較多，考慮為柴胡-桂枝治療AIS的關(guān)鍵成分。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤和心血管保護等多種生物活性[15]。腦組織耗能較高，一旦發(fā)生腦缺血，活性氧(ROS)產(chǎn)生過多，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可對腦細胞產(chǎn)生不可逆損傷[16]。槲皮素通過直接清除ROS、鰲合金屬離子以及抑制低密度脂蛋白氧化損傷等過程，發(fā)揮抗氧化的生物學(xué)功能，從而起到保護神經(jīng)的作用[17-18]。Han等[19]通過對PD小鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素能促進線粒體自噬，抑制mtROS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活，從而阻止神經(jīng)細胞損傷。山柰酚是一種強效的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多種作用[20]。Liu等[21]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚可以通過下調(diào)ROS依賴的MAPKs-NF-κB號通路，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Li等[22]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，山柰酚能減弱ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡。Han等[23]認為，山柰酚能減輕脂質(zhì)沉積和過氧化以及由此導(dǎo)致死亡也有研究結(jié)果證實，山柰酚能通過提高小鼠腦海馬超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平，改善其空間記憶障礙[24]。谷甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇等屬于植物甾醇類成分，具有較好的血-腦脊液屏障通透性，能透過血-腦脊液屏障發(fā)揮抗氧化的生物活性，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡，起到改善神經(jīng)功能的作用[25]。Jiang等[26]的研究結(jié)果表明，β-谷甾醇能作用于miRNA靶點，具有血管內(nèi)皮保護和抗動脈粥樣硬化的作用，能降低AIS的高危因素以及改善預(yù)后。異鼠李素是一種黃酮類物質(zhì)，具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗腫瘤、抗炎和抗病毒等作用[27]。Wu等[28]發(fā)現(xiàn)異鼠李素能通過Akt/SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路對缺血再灌注腦損傷起到保護作用。Rodríguez等[29]發(fā)現(xiàn)，異鼠李素能在不影響ROS的情況下具有抗血小板、抗血栓的作用。

本研究中，通過STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件分析柴胡-桂枝抗腦缺血的作用靶點包括AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等。AKT1為PI3K/AKT信號通路中的核心因子，參與代謝、增殖、細胞存活和血管生成等多種生物學(xué)過程[30]。AKT可通過促進NF-κB蛋白的表達，擾亂下丘腦-垂體-腎上腺軸功能，使炎癥反應(yīng)失調(diào)[31]。IL-6和TNF是重要的炎癥因子，參與機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，與腦血管疾病的炎癥過程密切相關(guān)[32]。VEGFA為血管內(nèi)皮生長因子，是一種缺氧誘導(dǎo)信號糖蛋白，具有維護內(nèi)皮細胞完整、促進血管再生的作用，還可以通過壞死物的清除、氧和代謝物的交換，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)[33]。但是，VEGFA參與了缺血早期的炎癥和腦水腫過程。Stavchanskiǐ等[34]通過研究發(fā)現(xiàn)，缺血會增加大鼠腦中VEGFA mRNA水平，并且采用多肽semax抑制缺血早期VEGFA基因表達的激活，可以起到神經(jīng)保護作用。TP53為細胞增殖調(diào)節(jié)基因，在細胞代謝、增殖、生長以及凋亡等方面發(fā)揮重要作用[35]。CASP3是細胞凋亡基因，參與缺血再灌注損傷過程，能加重腦梗死程度。龐艷利等[36]通過降低CASP3的表達，抑制細胞凋亡及縮小缺血再灌注損傷造成的腦梗死體積，起到了保護腦組織的作用。AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等6個核心靶點與炎癥、血管、細胞凋亡和神經(jīng)調(diào)節(jié)等相關(guān)，也說明柴胡-桂枝的抗AIS機制與上述生物功能有關(guān)。

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，柴胡-桂枝有效成分可能過參與對無機物的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、活性氧類代謝、對傷害的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路和循環(huán)系統(tǒng)過程等生物學(xué)過程，在薄膜筏、囊泡腔、樹突、細胞質(zhì)核周區(qū)、膜側(cè)和突觸后膜等部位，發(fā)生蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和細胞因子受體結(jié)合等分子反應(yīng)，進而調(diào)控癌癥通路、AGE-RAGE通路、丙型肝炎通路、HIF-1 信號通路和鉑耐藥等通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)一方面可以增加血管通透性，導(dǎo)致血管舒張功能障礙；另一方面可以增加血小板聚集，導(dǎo)致動脈粥樣硬化[37-38]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是晚期糖基化終產(chǎn)物受體，可促進ROS、促炎細胞因子產(chǎn)生，激活NF-κB，以及促進細胞黏附分子的產(chǎn)生[39-40]。田玉雙等[41]通過對人腦梗死組織標(biāo)本進行研究，發(fā)現(xiàn)患側(cè)腦組織中的RAGE水平明顯升高，提示RAGE與細胞的凋亡有關(guān)。Sapkota等[42]的研究結(jié)果表明，RAGE參與了腦缺血發(fā)生后溶血磷脂酸受體5介導(dǎo)的腦損傷。HIF-1為缺氧誘導(dǎo)因子，參與了生物體的氧氣供應(yīng)、細胞代謝等病理過程[43]；其具有介導(dǎo)糖酵解相關(guān)酶的產(chǎn)生、介導(dǎo)促紅細胞生成素基因表達、提高血液載氧能力和介導(dǎo)線粒體自噬途徑促進細胞存活的作用，在缺氧性損傷中發(fā)揮重要作用[44-45]。同時，AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等關(guān)鍵靶點，大部分也顯著富集在上述信號通路上，表明柴胡-桂枝具有多靶點、多通路的協(xié)調(diào)治療作用。

為了驗證結(jié)果的可靠性，本研究對篩選出的2個對應(yīng)疾病靶點基因最多的成分(槲皮素、山柰酚)與其對應(yīng)的關(guān)鍵靶點進行分子對接。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述2個核心成分與對應(yīng)的關(guān)鍵靶點均具有較好的結(jié)合活性(結(jié)合能<-20.93 kJ/mol)，其中槲皮素與TNF，山柰酚與TNF、CASP3均具有較強的結(jié)合活性(結(jié)合能均<-29.30 kJ/mol)，進一步驗證了預(yù)測結(jié)果的可靠性。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對柴桂-桂枝抗AIS的活性成分、關(guān)鍵靶點及作用通路進行預(yù)測，并采用分子對接的方法進行驗證。結(jié)果顯示，柴胡-桂枝可能通過槲皮素、山柰酚等主要活性成分，作用于AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53和CASP3等關(guān)鍵靶點，參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和循環(huán)等生物學(xué)過程，調(diào)控癌癥通路、AGE-RAGE信號通路和HIF-1信號通路，發(fā)揮治療AIS的作用，具有多成分、多靶點和多通路的特點。本研究也為后續(xù)的實驗提供了依據(jù)，可作為下一步實驗的前期基礎(chǔ)。