宋波，張曉杰，王俊生，嚴志軍，劉志堅，潘新祥

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾161000；3.大連海事大學信息學院 ，遼寧 大連 116026；4.廣東海洋大學校長，廣東 湛江 524088)

0 引言

隨著抗生素的過度使用，耐藥菌株逐年上升，使控制耐藥菌感染性疾病的治療壓力不斷增大。我國傳統(tǒng)藥用植物資源豐富，來源廣，毒副作用小，價格低廉，有些天然植物或者其提取液具有良好的抗菌活性，且較少出現(xiàn)耐藥性，具有良好的應用前景，從中藥中篩選微生物抑制劑具有重要意義[1-2]。中藥在我國分布廣泛，歷史悠久，經(jīng)常被用于治療各種炎癥、頭痛眩暈、心血管疾病和呼吸道疾病[3-5]。本文通過檢測中醫(yī)院呼吸道感染藥方，采用常用的清熱解毒抗菌類中草藥菊花、金銀花、連翹、炒苦杏仁、麻黃、射干、板藍根、荊芥、桔梗、淡豆豉、石膏、知母、桑葉、甘草對臨床標本大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌進行抑菌效果觀察，探討中草藥對菌株的體外抗菌活性，以為研發(fā)抗耐藥菌新藥提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均由齊齊哈爾醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科提供，采用美國BD公司細菌鑒定儀phoenix100進行菌種鑒定。質(zhì)控菌株為大腸桿菌(ATCC 25922)，金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)[6]，白色念珠菌(ATCC10231)均由齊齊哈爾醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供。

1.2 菌懸液的制備

將采集的菌株，以平板劃線的方式接種于滅菌的LB固體培養(yǎng)基上進行活化，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，用接種環(huán)挑取單個菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中，菌懸液制備完成[7]。

1.3 中藥

根據(jù)齊齊哈爾市中醫(yī)院呼吸道感染常用藥方選取菊花、金銀花、連翹、炒苦杏仁、麻黃、射干、板藍根、荊芥、桔梗、淡豆豉、石膏、知母、桑葉、甘草14種中藥，以上中藥均購于齊齊哈爾市中醫(yī)院。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥敏紙片擴散法測量抑菌圈直徑

藥敏紙片的制備：精確稱取菊花等中藥，使用pH=7.6的PBS配制，使其藥液濃度為2g生藥/mL，4℃保存?zhèn)溆肹8]。使用打孔器將濾紙制作為直徑6mm的小紙片，高壓鍋121℃，滅菌15min后備用，制備成濃度為1：1原液的含藥紙片，每張紙片中含有10μL的中藥。藥敏紙片擴散法：通過測量抑菌圈直徑來判斷中藥液的抗菌敏感性。在MH培養(yǎng)基上分別將0.5 MCF的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌均勻涂滿整個平板，在平板培養(yǎng)基上等間距地貼上藥敏紙片，含滅菌水的空白藥敏紙片作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)24 h后，使用游標卡尺以十字交叉法測量各中藥液的抑菌圈直徑，每組做3個平行試驗，計算其平均值[2]。

1.4.2 微量肉湯稀釋法分析菊花等中藥對細菌的最低抑菌濃度(MIC)菌液的制備

分別取一接種環(huán)的待測菌，接種至LB液體培養(yǎng)基中，配制成濃度約為0.5 MCF(1.5×108cfu/mL)的菌液。藥液的制備：采用2倍稀釋法將濃度為2000 mg/mL的連翹等中藥液用無菌水等比稀釋原則，使其稀釋成濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.813、3.906 mg/mL的藥液。微量肉湯稀釋法：在含有不同稀釋度藥液的96孔板中，每孔加入待測菌液100μL，每個濃度各設3支平行管，混勻。不含藥液的菌液稀釋液作為陽性對照，無菌水作為陰性對照。37℃培養(yǎng)24h，從各孔中取出10μL液體，接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察實驗孔和陰陽對照孔的細菌生長情況。以無菌生長平板(清澈透明)的最低藥物濃度為MIC[7]。

2 結果

2.1 連翹等中藥對細菌的抑菌效果的觀察

通過觀察中藥藥敏紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，判斷該中藥對細菌是否具有抑菌作用。由表1可知，對大腸桿菌有抑菌效果的中藥是菊花、金銀花、連翹、荊芥、知母、桑葉、甘草，對金黃色葡萄球菌有抑菌效果的中藥是金銀花、連翹、知母、桑葉、甘草，對白色念珠菌有抑菌效果的中藥是連翹、桑葉、甘草。

2.2 七種敏感中藥抑菌環(huán)直徑的測量

抑菌結果的判定：抑菌圈直徑＜7.5 mm為耐藥；在7.5～10 mm為輕度敏感；在10～14 mm為中度敏感；在15～20 mm為高度敏感；＞20 mm為極度敏感[8-9]。由表2和圖1可知，不同中草藥的抑菌作用效果不一樣，連翹和荊芥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均＞20 mm，屬于極度敏感，甘草對供試菌菌的抑菌圈直徑均＞10 mm，屬于敏感，但是對白色念珠菌中度敏感，桑葉對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑＞10 mm，屬于敏感，但是對白色念珠菌不敏感，菊花對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈直徑＞10mm，屬于中度敏感，對白色念珠菌表現(xiàn)為低度敏感。七種中草藥對金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，連翹的抑菌效果尤為明顯，抑菌圈的直徑為21 mm；對大腸桿菌均有抑制作用，其中荊芥的抑菌效果最好，抑菌圈的直徑達到了22 mm；甘草、菊花、連翹、金銀花、荊芥、桑葉對白色念珠菌均有一定的抑菌作用，知母對白色念珠菌無抑菌環(huán)產(chǎn)生，屬于無抑菌作用。

2.3 七種敏感中藥對細菌的最低抑菌濃度(MIC)測定

為了解各中藥對細菌的抗菌效果，選取敏感中藥菊花、金銀花、連翹、荊芥、知母、甘草、桑葉七種中草藥，按二倍稀釋法分別稀釋成不同的濃度梯度，通過測定每種中藥的最低抑菌濃度(MIC)對其抗菌效果進行研究，結果見表3、4、5。

菊花、金銀花、連翹、荊芥、知母、甘草、桑葉對大腸桿菌最低抑菌濃度MIC值為0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.25 mg/mL 、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.25 mg/mL，菊 花、金銀花、連翹、荊芥、知母、甘草、桑葉對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度MIC為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.25 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL，菊花、金銀花、連翹、荊芥、甘草、桑葉對白色念珠菌的最低抑菌濃度MIC為0.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL。

表1 連翹等中藥對細菌的抑菌效果的觀察

表2 七種敏感中藥對細菌的抑菌環(huán)直徑的比較(mm)

圖1 七種敏感中藥對細菌的抑菌環(huán)直徑的圖示

表3 七種中藥對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)

表4 七種中藥對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)

表5 七種中藥對白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)

3 討論

3.1 研究結果及國內(nèi)外同類研究比較

本研究結果表明，連翹、荊芥、甘草、桑葉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有較強的抑制作用，由表2可知，荊芥對金黃色葡萄球菌抑制能力較強，對大腸桿菌中度敏感，對白色念珠菌抑制能力較弱，這與研究報道[9-11]荊芥揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌結果相符。連翹、甘草對金黃色葡萄球菌的抗菌活性較好，甘草對于大腸埃希菌、白色念珠菌的抗菌活性差別不大，這與研究報道[12]一致。研究表明本組藥物產(chǎn)生抑菌作用的主要藥物是連翹與荊芥，是兩種抑菌譜很廣的、抑菌效果很好的中藥，與前人研究結果[13]吻合。甘草、菊花、連翹、金銀花、荊芥、桑葉對白色念珠菌均有抑菌作用，但知母對白色念珠菌無抑菌作用，該結果與楊坤等[14]的報道結果不同，可能知母作為聯(lián)合用藥時可以發(fā)揮其協(xié)助抑菌作用，但單獨使用時，未產(chǎn)生抑菌作用。

呼吸道感染是導致院內(nèi)感染死亡的主要原因，且近年來其感染致死率呈上升趨勢[15]。金黃色葡萄球菌[16-18]，大腸桿菌[19-20]和白色念珠菌[21-22]是人類呼吸道感染的常見病原菌，目前對傳統(tǒng)抗生素耐藥率高，且有逐年上升趨勢，及時準確的藥物治療對改善患者的結局具有很重要的意義[23]。

3.2 研究的創(chuàng)新性、先進性

中藥在我國分布廣泛，可有廣譜抗菌、免疫調(diào)節(jié)、安全及副作用小等多種用途[24-25]。本研究選擇中醫(yī)院呼吸道感染常用藥方，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌為代表菌進行藥物的初步篩選，采用了抑菌環(huán)直徑和MIC兩種指標顯示各種中藥抑菌效應的強弱，觀察抑菌效果，評價藥方中14種中草藥抗菌效果的差異。

3.3 研究的不足及展望

本研究不足之處在于樣本量小以及選用的測試菌種類較少，未來將擴大樣本量以及增加測試菌樣品種類繼續(xù)進行深入研究，