施 琳，叢培芳，佟昌慈，柳云恩

由于恐怖事件、瓦斯等爆炸事件的增多，爆震傷成為現(xiàn)代戰(zhàn)爭中及非戰(zhàn)爭人員中越來越常見的創(chuàng)傷[1]。肺通常是原發(fā)性爆震損傷的主要部位[2]，爆震產(chǎn)生的沖擊波會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)血管-肺泡界面的破壞，導(dǎo)致肺泡壁破壞、實(shí)質(zhì)出血等并導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征[3]。因此，尋求可以減輕胸部爆震致肺損傷的方法，對(duì)救治傷員具有重要意義。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胸部爆震可導(dǎo)致肺組織發(fā)生炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，并且與PI3K信號(hào)通路的激活相關(guān)。姜黃素(curcumin，CUR)是傳統(tǒng)藥物姜黃的一種成分，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，它被用于治療多種疾病。研究表明CUR具有包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎和抗真菌活性在內(nèi)的許多藥理作用[4]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)CUR可能與一些以異常炎性反應(yīng)為特征的肺部疾病有關(guān)，例如，哮喘或慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合征、肺纖維化和急性肺損傷[5, 6]。然而，CUR能否減輕小鼠胸部爆震引起的肺損傷則尚不清楚。本研究旨在探討CUR對(duì)胸部爆震致小鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 30只健康雄性8周齡C57BL/6小鼠購自本溪長生生物科技有限公司，體重(21±2)g。CUR購自美國sigma公司。實(shí)驗(yàn)所需兔單克隆抗體MDA5、IRE-a、SOD-1、p-PI3K、PI3K、Keap1、Nrf2和GAPDH，以及山羊抗兔二抗均直接購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 30只雄性小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和模型+CUR組，每組10只。采用爆震傷裝置建立小鼠胸部爆震模型。方法如下：小鼠禁食水后12 h，以碘伏消毒小鼠腹部皮膚，0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉后置于爆震傷裝置上，構(gòu)建爆震模型。模型+CUR組于爆震前2 周開始干預(yù)。對(duì)照組和模型組小鼠腹腔注射10 mg/kg生理鹽水，1次/d，連續(xù)2周；模型+CUR組小鼠腹腔注射2.5 mg/kg CUR，1次/d，連續(xù)2周。爆震后48 h麻醉并脊髓脫臼處死所有小鼠，收集肺組織標(biāo)本。左肺進(jìn)行10%甲醛固定并石蠟包埋切片，右肺-80 ℃保存。

1.2.2 HE染色 將切片脫蠟至水后放入蘇木精(HE)中，浸泡5 min。自來水沖洗，放入1%鹽酸乙醇中分化數(shù)秒。自來水流水沖洗，0.5%氨水返藍(lán)數(shù)秒。自來水沖洗1 min，鏡下控制細(xì)胞核分化程度。1%伊紅水溶液染色1.5 min。切片適度自來水洗后依次浸入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中，每次停留1 min。浸入無水乙醇Ⅰ及無水乙醇Ⅱ中各浸泡1 min，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。依次取出切片，滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片，室溫晾干。

1.2.3 ROS檢測 冷凍切片于PBS中浸泡5 min，二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)10 μM避光孵育20 min，PBS中浸泡 5 min后封片，熒光顯微鏡鏡下觀察照相。在紫外光激發(fā)下，組織內(nèi)未氧化的DHE發(fā)出藍(lán)色熒光，而已氧化的DHE發(fā)出紅色熒光。

1.2.4 Western blot檢測 采用Western blot技術(shù)，檢測肺組織氧化應(yīng)激蛋白MDA5、IRE-α 和SOD-1的表達(dá)，同時(shí)檢測p-PI3K、Nrf2和Keap1信號(hào)通路蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺泡排列較規(guī)則、間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肺泡破裂，融合成肺大泡，肺泡間隔增厚，間質(zhì)內(nèi)可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。CUR處理組小鼠肺泡間隔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖1)。

圖1 小鼠肺組織病理改變(HE，×200)

2.2 肺組織氧化應(yīng)激損傷 ROS結(jié)果顯示，爆震后，在紫外光激發(fā)下，小鼠肺組織紅色熒光明顯，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，而模型+CUR組的紅色熒光明顯減少，藍(lán)色熒光增多，說明CUR可以改善小鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)(圖2)。

圖2 小鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)(×200)

2.3 肺組織氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá) 模型組與對(duì)照組相比，小鼠氧化應(yīng)激蛋白MDA5和IRE-α明顯升高，而SOD-1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型+CUR組與模型組相比，小鼠MDA5和IRE-α蛋白表達(dá)降低，SOD-1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3，表1)。

圖3 小鼠肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白的相對(duì)表達(dá)

2.4 CUR改善模型組小鼠肺組織PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表達(dá) 模型組與對(duì)照組相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表達(dá)顯著增加，而Nrf2則明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型+CUR組與模型組相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表達(dá)顯著減少，Nrf2蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4，表2)。

圖4 小鼠肺組織PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表達(dá)

表2 各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

肺臟是爆震傷中最常累及的器官，也是導(dǎo)致傷員死亡最常見的致命傷之一。而ALI更是胸部爆震后的常見損傷，ALI通常伴隨炎性反應(yīng)、活性氧釋放、谷氨酸毒性和線粒體功能障礙等多種發(fā)病機(jī)制的參與。本研究發(fā)現(xiàn)，CUR處理顯著降低胸部爆震引起的肺組織炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，胸部爆震早期，肺泡壁斷裂，毛細(xì)血管床減少；肺間質(zhì)可見明顯水腫。而PO2、TCO2、HCO3-及肺干濕重比也在ALI后明顯下降，12 h達(dá)到最低。血清及肺組織促炎性因子TNF-α、IL-4和IL-6表達(dá)顯著升高，而抑炎因子IL-10表達(dá)顯著降低，其后，氧化應(yīng)激及凋亡反應(yīng)逐步發(fā)生[7]。

CUR是一種黃色色素，存在于香料姜黃中。其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮是通過調(diào)節(jié)多個(gè)分子靶點(diǎn)，通過多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子、炎性細(xì)胞因子、酶、生長因子及受體的表達(dá)來介導(dǎo)的，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)胸部爆震后，小鼠肺泡間隔內(nèi)的炎性反應(yīng)細(xì)胞明顯減少，同時(shí)ROS生成明顯增多，氧化應(yīng)激蛋白MDA5和IRE-a升高，抗氧化應(yīng)激蛋白SOD-1降低。以上結(jié)果均說明肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯。在本研究中，CUR干預(yù)后的小鼠與模型組相比，肺組織內(nèi)炎性反應(yīng)明顯降低，ROS生成減少，氧化應(yīng)激蛋白MDA5、IRE-a及抗氧化應(yīng)激蛋白SOD-1的變化也得到改善。

Nrf2是一種bZIP轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)一系列抗氧化和細(xì)胞應(yīng)激基因?qū)寡趸瘧?yīng)激發(fā)揮著重要作用。在正常條件下，Nrf2通過快速泛素化和蛋白酶體依賴性降解維持在較低水平。然而，在氧化應(yīng)激期間其可在多個(gè)器官中被與其共定位的Keap1抑制[9]。許多研究也證實(shí)，調(diào)節(jié)PI3K/Nrf2通路可以減輕大鼠急性腎損傷和急性肺損傷，減輕胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激[10, 11]。本研究發(fā)現(xiàn)，CUR可以顯著降低氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)，提高抗氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)，同時(shí)影響PI3K/Nrf2/Keap1信號(hào)通路，結(jié)果提示CUR對(duì)小鼠胸部爆震致肺損傷有保護(hù)作用，其潛在機(jī)制可能與抑制PI3K的磷酸化及激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路相關(guān)。類似的研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚與丹參素合用通過Nrf2/HO-1和PI3K/Akt途徑抑制氧化應(yīng)激，減輕心肌梗死大鼠的細(xì)胞凋亡[12]。而CUR可以通過激活Nrf2來減少脂質(zhì)過氧化，并維持各種抗氧化酶的活性狀態(tài)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶[13]。本研究結(jié)果提示，CUR可以顯著降低胸部爆震引起的p-PI3K和Keap1的表達(dá)升高，增加爆震后降低的Nrf2的表達(dá)。

綜上，CUR處理對(duì)小鼠胸部爆震致肺損傷有保護(hù)作用，其潛在機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)PI3K/Nrf2/Keap1信號(hào)通路相關(guān)。