石鳳垚,李文慧,趙紅宇,王 陽,莊瑞雪,芮 榮,劇世強(qiáng)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 南京 210095)

近年來，因江、河、湖泊等水體富營養(yǎng)化日益加重所導(dǎo)致的藍(lán)藻水華(cyanobacteria bloom)頻繁爆發(fā)已引起公眾的廣泛關(guān)注，尤其是由富營養(yǎng)化水體中藍(lán)藻所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物-微囊藻毒素(microcystins, MCs)，分布范圍廣，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且毒性作用強(qiáng)，可對(duì)動(dòng)物及人類健康造成嚴(yán)重威脅[1-4]。MCs極易溶于水，耐熱且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，現(xiàn)有手段很難將其從飲用水源中去除[5]。MCs可通過受污染的飲用水、水產(chǎn)品、農(nóng)作物及飼料等途徑進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，并通過食物鏈累積效應(yīng)使動(dòng)物機(jī)體積累更高濃度的MCs，對(duì)機(jī)體肝、腎、生殖、神經(jīng)等組織器官產(chǎn)生毒性作用[6-8]。在目前已知的200多種MCs異構(gòu)體中[4]，微囊藻毒素-LR (MC-LR)是分布最廣，且毒性作用最強(qiáng)的一種微囊藻毒素[9-11]。已有研究表明，MC-LR對(duì)動(dòng)物肝、腎等多種組織器官均具有明顯的毒性損傷作用[12-15]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物性腺也是MC-LR重要的靶器官之一[13,16]，MC-LR不僅可以在肝、腎等多種組織中積聚，也會(huì)在動(dòng)物的性腺中積累，并產(chǎn)生毒性損傷，影響動(dòng)物的生殖功能[17-20]。研究表明，長期接觸MC-LR會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠精子數(shù)量減少、活力降低，并使血清睪酮水平明顯下降[21]；可引起大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性氧(ROS)激增，致使細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。在對(duì)雌性動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，MC-LR可導(dǎo)致小鼠卵巢內(nèi)高質(zhì)量卵泡數(shù)量減少、血清激素水平紊亂，并導(dǎo)致發(fā)情周期異常[23]；還可使中國倉鼠卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞骨架，致使細(xì)胞周期阻滯，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24-25]。這些結(jié)果初步揭示了MC-LR對(duì)動(dòng)物生殖也具有潛在的毒性作用。

本試驗(yàn)以體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，通過免疫熒光結(jié)合激光共聚焦成像等技術(shù)分析不同濃度MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞骨架、氧化應(yīng)激以及早期凋亡的影響，探究MC-LR對(duì)動(dòng)物卵母細(xì)胞的毒性損傷作用，為后續(xù)進(jìn)一步研究MC-LR的生殖毒性作用及其機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

微囊藻毒素-LR (MC-LR)購自普瑞邦生物工程有限公司；TCM 199購自Gibico公司；鼠抗α-tubulin-FITC單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司；活性氧(ROS)試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司。其他試劑若無特殊標(biāo)注均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)與處理

豬卵巢樣品購自南京元潤食品有限公司屠宰場，置于37 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。選取卵巢上直徑約為3～6 mm的卵泡，抽取其中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes, COCs)，在體視顯微鏡下挑撿胞質(zhì)均勻、且包被3層以上卵丘細(xì)胞的COCs。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將所收集的COCs隨機(jī)分為4組，分別置于已添加不同濃度MC-LR (0、20、40和60 μg·mL-1)的TCM199培養(yǎng)液中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。在體外成熟培養(yǎng)44 h后收集COCs，經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶消化，去除卵丘細(xì)胞后，分別進(jìn)行第一極體(first polar body，PbⅠ)鏡檢、免疫熒光染色及RT-qPCR等檢測。

1.3 間接免疫熒光染色

將所收集的卵母細(xì)胞樣品，用4%多聚甲醛室溫固定1 h后轉(zhuǎn)入1% 的TritonX-100中于飽和濕度的濕盒中室溫通透8 h，再用1%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)于濕盒中室溫封閉1 h， 之后與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的抗α-tubulin-FITC抗體(1∶200)在室溫孵育2 h，最后用10 μg·mL-1的Hoechst33342避光染色15 min后進(jìn)行封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察分析。

1.4 卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

試驗(yàn)前用TCM 199成熟培養(yǎng)液將DCFH-DA稀釋成10 μmol·L-1工作液，置于培養(yǎng)箱中平衡30 min。 將去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞移入PBS中清洗3次后置于工作液中，于培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。 孵育完成并經(jīng)PBS清洗3次后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

1.5 卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量測定

將去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞移入PBS中洗3次，再移入含1 mL PBS的離心管中，按照谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒說明書介紹的方法對(duì)各組卵母細(xì)胞GSH-Px酶活力進(jìn)行測定。

1.6 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測

將去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞移入PBS中清洗3次， 按照Annexin V-FITC凋亡檢測盒說明書介紹的方法，將卵母細(xì)胞置于含5% Annexin-V-FITC的PBS緩沖液中，在37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育10 min，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察分析。

1.7 氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因RT-qPCR測定

每組收集100枚卵母細(xì)胞樣品，按 Trizol 試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照TB Green qPCR試劑盒說明書檢測 mRNA 的表達(dá)水平，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線檢測特異性。用 2-ΔΔCT法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences used for real-time PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度MC-LR(0、20、40、60 μg·mL-1)對(duì)豬卵母細(xì)胞PbⅠ排出影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖1。隨著MC-LR毒素濃度增加，卵母細(xì)胞PbⅠ排出率呈明顯的下降趨勢(shì)，并具有劑量依賴性。與對(duì)照組(73.20%)相比，20 μg·mL-1MC-LR試驗(yàn)組的PbⅠ排出率(69.59%)略有下降，并無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)MC-LR作用濃度分別達(dá)到40 和60 μg·mL-1時(shí)，卵母細(xì)胞PbⅠ排出率分別極顯著下降至59.96% (P<0.01)與51.64% (P<0.001)。 這一研究結(jié)果表明，當(dāng)MC-LR作用濃度達(dá)到40 μg·mL-1及以上時(shí)，豬卵母細(xì)胞PbⅠ排出受到極顯著抑制，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程受阻。

A. MC-LR處理導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞第一極體(PbⅠ)排出失敗; B. MC-LR處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞PbⅠ排出率顯著下降：n表示卵母細(xì)胞樣本數(shù)。**.P<0.01, ***.P<0.001。下圖同A. Oocytes failed to extrude the first polar bodies (PbI) after MC-LR treatment; B. The PbI extrusion rate was significantly reduced after MC-LR treatment: n. Sample number. **. P<0.01, ***. P<0.001. The same as below圖1 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響Fig.1 Effect of MC-LR on the maturation in vitro of porcine oocytes

2.2 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)的影響

為探究MC-LR抑制豬卵母細(xì)胞PbⅠ排出的原因，本研究采用間接免疫熒光染色與激光共聚焦成像技術(shù)檢查并分析了MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細(xì)胞紡錘體及染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)分布的變化情況。由圖2A可見，經(jīng)44 h體外成熟培養(yǎng)，對(duì)照組卵母細(xì)胞的微管蛋白α-tubulin組裝成典型的紡錘體結(jié)構(gòu)，且染色體整齊排列在赤道板上；而處理組卵母細(xì)胞的微管蛋白α-tubulin分布紊亂，紡錘體結(jié)構(gòu)異常，染色體也隨之無規(guī)律排列。由圖2B可見，與對(duì)照組(25.13%)相比，MC-LR處理組的紡錘體異常率極顯著升高(62.52%，P<0.001)。這一結(jié)果提示，MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的毒性損傷作用。

A. MC-LR處理導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)異常(綠色:紡錘體; 藍(lán)色:染色體); B. MC-LR處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞錘體結(jié)構(gòu)異常率顯著升高A. MC-LR treatment resulted in abnormal spindle structure of porcine oocytes (Green: Spindle; Blue: Chromosome); B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in spindle structure abnormality rate of porcine oocytes圖2 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of MC-LR treatment on the spindle structure of porcine oocytes

2.3 MC-LR誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的檢測

為進(jìn)一步研究MC-LR處理導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞成熟失敗的原因，利用熒光探針DCFH-DA檢測了MC-LR (60 μg·mL-1)處理后卵母細(xì)胞ROS水平的變化情況，結(jié)果見圖3。MC-LR處理組卵母細(xì)胞的ROS平均熒光強(qiáng)度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

A.MC-LR 處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞ROS水平升高；B．MC-LR 處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度顯著升高A.MC-LR treatment resulted in higher ROS levels in oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the average fluorescence intensity of ROS in oocytes圖3 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞ROS水平的影響Fig.3 Effect of MC-LR treatment on ROS levels in porcine oocytes

在檢測卵母細(xì)胞ROS水平基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究MC-LR處理對(duì)豬卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，檢測分析了MC-LR作用對(duì)卵母細(xì)胞GSH-Px活力及抗氧化相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4A所示，MC-LR處理組卵母細(xì)胞GSH-Px活力極顯著降低(P<0.01)；從圖4B可知，MC-LR處理組卵母細(xì)胞，除SOD2無明顯變化外，SOD1、CAT和GSH-Px的mRNA水平均極顯著下降(P<0.01)。說明，MC-LR處理導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞在體外成熟過程中產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激，且卵母細(xì)胞的抗氧化能力顯著下降。

A.MC-LR處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞GSH-Px活力顯著降低；B．MC-LR處理對(duì)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響A.MC-LR treatment resulted in lower GSH-Px levels in oocytes; B. Effect of MC-LR treatment on the expression of oxidative stress related genes in oocytes圖4 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞GSH-Px活力及抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of MC-LR treatment on GSH-Px activity and mRNA expression of oxidative stress related genes in porcine oocytes

2.4 MC-LR引發(fā)豬卵母細(xì)胞凋亡的檢測

因氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在檢測卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過Annexin-V染色檢測MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細(xì)胞早期凋亡情況，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，MC-LR 處理后卵母細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞比率從28.53%極顯著升高至59.35%(P<0.01)。

A.MC-LR 處理誘導(dǎo)了卵母細(xì)胞早期凋亡；B.MC-LR 處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡率顯著升高A.MC-LR treatment induced the early apoptosis of oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the apoptosis rate of oocytes圖5 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞早期凋亡的影響Fig.5 Effect of MC-LR treatment on the early-stage apoptosis of porcine oocytes

為進(jìn)一步研究MC-LR處理對(duì)豬卵母細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)分析了MC-LR處理后卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl2 的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，MC-LR處理后，BaxmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl2 mRNA的表達(dá)極顯著下調(diào)(P<0.001)，Bax/Bcl2的比值極顯著升高(P<0.001)。

圖6 MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effect of MC-LR treatment on the mRNA expression of early apoptosis related genes in porcine oocytes

3 討 論

MC-LR是所有微囊藻毒素中毒性最強(qiáng)的一類環(huán)狀七肽，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分布廣泛，可通過飲用水或受污染的食物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)多種組織器官產(chǎn)生毒性作用。已有研究表明，MC-LR可在卵巢中積累并產(chǎn)生生殖毒性[23]，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)卵泡閉鎖，致使小鼠不育[24-25]。MC-LR甚至還可以通過胎盤屏障影響胎兒肝、腎及大腦等組織器官的形成和發(fā)育[26-28]。這些結(jié)果表明，MC-LR對(duì)雌性動(dòng)物的生殖發(fā)育具有潛在的毒性作用，但MC-LR是否會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用目前尚不明確。本研究以體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞為研究模型，探討了不同濃度MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的毒性損傷作用，結(jié)果表明，MC-LR可顯著抑制豬卵母細(xì)胞成熟，其毒性作用機(jī)制與誘導(dǎo)紡錘體結(jié)構(gòu)損傷、引發(fā)氧化應(yīng)激與早期細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本研究首先發(fā)現(xiàn)，MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟具有明顯的抑制作用，并具有劑量依賴性，當(dāng)以40 μg·mL-1以上MC-LR處理豬卵母細(xì)胞時(shí)，其第一極體排出率會(huì)顯著下降。在動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，紡錘體的正確組裝與動(dòng)態(tài)分布對(duì)于染色體的精確分離與極體的順利排出等生物學(xué)事件起著至關(guān)重要的作用[29]。因此，本研究進(jìn)一步通過激光共聚焦掃描技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的紡錘體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC-LR作用后卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重缺陷，并伴隨同源染色體分離的異常，導(dǎo)致卵母細(xì)胞第一極體排出失敗。這一結(jié)果提示，MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的毒性損傷作用。已有的研究結(jié)果也證實(shí)，MC-LR可對(duì)其他多種細(xì)胞模型的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)造成損傷[30-31]，F(xiàn)range?等[32]在兔胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，用10 μmol·L-1的MC-LR處理胚胎細(xì)胞24 h，即可導(dǎo)致細(xì)胞的紡錘體微管在細(xì)胞核周圍發(fā)生塌陷并重組，Chen等[33]以雄性大鼠為研究模型，進(jìn)一步從基因轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)，MC-LR可破壞睪丸組織細(xì)胞骨架相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性。這些研究結(jié)果表明，MC-LR可通過破壞細(xì)胞的紡錘體微管系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷。在本研究中，MC-LR使卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，進(jìn)而影響了同源染色體精確分離，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞第一極體無法排出。

已有研究表明，MC-LR的毒性作用機(jī)制主要是通過產(chǎn)生過量的ROS來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，引發(fā)細(xì)胞凋亡[34-35]。哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞和胚胎對(duì)ROS十分敏感，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、胚胎發(fā)育及細(xì)胞死亡等生理過程中，ROS發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它和抗氧化劑之間的動(dòng)態(tài)平衡確保了卵母細(xì)胞及胚胎正常發(fā)育[36-37]。為進(jìn)一步驗(yàn)證MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的毒性作用機(jī)制是否與氧化損傷有關(guān)，本研究對(duì)MC-LR處理后卵母細(xì)胞的ROS水平及抗氧化相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-Px的表達(dá)進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的ROS水平顯著增加，提示MC-LR處理導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，與此同時(shí)，部分抗氧化酶基因(SOD1、CAT和GSH-Px)表達(dá)水平也明顯下調(diào)，進(jìn)一步說明MC-LR作用44 h后，卵母細(xì)胞的抗氧化能力已顯著下降。因此推測，MC-LR誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，并破壞了細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。細(xì)胞的氧化損傷與凋亡密切相關(guān)，高水平的ROS會(huì)通過改變線粒體通透性破壞線粒體動(dòng)力學(xué)，引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致由線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[38-41]。本試驗(yàn)通過Annexin-V染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MC-LR處理的卵母細(xì)胞早期凋亡率顯著增加，RT-qPCR結(jié)果也顯示，凋亡相關(guān)基因Bax轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，Bcl2轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，Bax/Bcl2比值顯著升高。因此推測，MC-LR通過誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果證明，MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的損傷作用，致使第一極體無法排出，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟失??；MC-LR對(duì)豬卵母細(xì)胞的毒性損傷作用機(jī)制與誘導(dǎo)氧化損傷及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果為深入探討MC-LR對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。