李鵬飛, 龔真莉，杜曉華，蔣 韜*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)分布于世界各地，是一種具有高度傳染性的病毒性疾病[1-2]，因其具有重大的經(jīng)濟(jì)影響，被認(rèn)為是影響畜牧業(yè)發(fā)展最重要的疫病之一。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是引起FMD的病原體，屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，由O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 7種血清型組成[3]。FMD完整的病毒粒子為正二十面體對稱結(jié)構(gòu), 由VP1、VP2、VP3、VP44種結(jié)構(gòu)蛋白各60個拷貝組成, RNA分子被包裹在內(nèi)[4]。VP1～VP3 3種結(jié)構(gòu)蛋白暴露在病毒顆粒表面且聚集成蛋白質(zhì)三聚體復(fù)合物，較小的結(jié)構(gòu)蛋白VP4隱藏于內(nèi)部[5]。VP1蛋白是FMDV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在其易變的 G-H 環(huán)上不僅含有病毒主要的抗原位點，而且含有一個高度保守的RGD基序(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)，該基序是病毒粒子與細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白結(jié)合引起感染的主要結(jié)合位點。盡管RGD依賴的整聯(lián)蛋白受體通過RGD基序識別配體，但FMDV-VP1蛋白G-H環(huán)中VP1側(cè)面的氨基酸殘基在FMDV感染中同樣起重要作用。如RGD依賴性整聯(lián)蛋白αvβ5和α5β1并未充當(dāng)FMDV的受體[6]。VP1 S154D突變導(dǎo)致Asia1 型FMDV使用豬整聯(lián)蛋白受體αvβ6和αvβ8的能力增加，從而增加了其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制水平，增強了對宿主豬的致病性[7]。

整聯(lián)蛋白是哺乳動物細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白之一[8]。迄今為止，已鑒定18種不同的α亞基和8種β亞基非共價結(jié)合構(gòu)成24種整聯(lián)蛋白異二聚體跨膜糖蛋白受體，可與多種細(xì)胞或細(xì)胞外配體結(jié)合，通常整聯(lián)蛋白不具有活性，在活化后才能成為黏附劑[9]。整聯(lián)蛋白可以通過結(jié)合細(xì)胞外配體或通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞骨架相互作用，在細(xì)胞膜上雙向傳遞信號[10]。在非活性狀態(tài)下，整聯(lián)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域不與配體結(jié)合，以彎曲構(gòu)象形式存在。然而，來自細(xì)胞的信號引起構(gòu)象變化，暴露外部配體結(jié)合位點，結(jié)合配體并將信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)[11]。在體外，至少有4種整聯(lián)蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)可作為FMDV受體來介導(dǎo)FMDV感染宿主細(xì)胞[12]。研究發(fā)現(xiàn)，整聯(lián)蛋白αvβ6可能是決定FMDV 組織嗜性的主要受體，且FMDV可能會激發(fā)整聯(lián)蛋白αvβ6在上皮細(xì)胞中的表達(dá)，然后以網(wǎng)格蛋白依賴的方式內(nèi)化。表明整聯(lián)蛋白αvβ6不僅是FMDV的吸附受體，而且在病毒與受體結(jié)合后的脫殼、復(fù)制等過程中也發(fā)揮著重要作用[6]。研究證實，可溶性截短形式的牛整聯(lián)蛋白αvβ6通過二價陽離子依賴的方式結(jié)合FMDV-RGD，可用作FMDV的捕獲試劑，并不影響病毒的結(jié)合[13]。除整聯(lián)蛋白外，在細(xì)胞培養(yǎng)中，F(xiàn)MDV可以迅速適應(yīng)利用替代細(xì)胞受體: 硫酸乙酰肝素(HS)[14]和尚未確認(rèn)的替代受體[15]。研究證實，整聯(lián)蛋白α 和 β 亞基 N-末端形成的球形區(qū)域為胞外配體結(jié)合域[16]。

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)是一種基于光學(xué)的實時監(jiān)測方法，且因SPR技術(shù)無需標(biāo)記、靈敏度高、特異性高、實時和快速等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于各種生物分子相互作用的研究[17]。目前，尚未見國內(nèi)外采用SPR技術(shù)研究FMDV RGD基序與豬源整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域、αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和β6亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合動力學(xué)方面的報道。本研究在國內(nèi)首次利用基于SPR技術(shù)的Biacore 3000系統(tǒng)，研究了FMDV RGD基序與豬源整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域、αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和β6亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的相互作用，研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明FMDV與宿主細(xì)胞整聯(lián)蛋白受體的相互作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

豬源整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)、αv亞基胞外區(qū)和β6亞基胞外區(qū)由本實驗室原核表達(dá)并純化、鑒定得到。RGD(Arg-Gly-Asp)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Biacore 3000生物傳感器；Biacore 3000控制軟件；氨基偶聯(lián)試劑盒；CM5 Sensor Chip(CM5傳感器芯片)；不同 pH (4.0、4.5、5.0 和 5.5)的10 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液；HBS-EP 緩沖液；再生試劑盒均購自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 芯片表面預(yù)處理 開機(jī)后，首先將系統(tǒng)溫度設(shè)置為25 ℃，取出Maintaince 芯片，插入 CM5 芯片并固定，使用primer命令用純水沖洗管道，再換HBS-EP緩沖液，再次使用primer命令沖洗管道，最后通過HBS-EP緩沖液，直到基線穩(wěn)定，為下一步的試驗做好準(zhǔn)備。

1.2.2 偶聯(lián)pH的選擇 分別使用氨基偶聯(lián)試劑盒中pH4.0、4.5、5.0、5.5的10 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液稀釋目的蛋白樣品整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)、αv亞基胞外區(qū)和β6亞基胞外區(qū)至20 μg·mL-1，使其帶上不同量的電荷。再將整聯(lián)蛋白樣品以10 μL·min-1的流速流過芯片表面，注射2 min，通過整聯(lián)蛋白樣品與芯片的結(jié)合曲線確定合適的偶聯(lián)pH。最后，以20 μL·min-1流速注射30 μL 50 mmol·L-1NaOH洗脫液完全去除芯片表面吸附的樣品蛋白。

1.2.3 在CM5芯片上偶聯(lián)整聯(lián)蛋白 使用預(yù)處理篩選得到的最合適的pH偶聯(lián)緩沖液稀釋目的蛋白至20 μg·mL-1，應(yīng)用蛋白固定自動化程序進(jìn)行氨基偶聯(lián)。

1.2.4 結(jié)合試驗 將RGD基序溶解在HBS-EP運行緩沖液中，并稀釋至低濃度(31.25 μg·mL-1)和高濃度(500 μg·mL-1),以10 μL·min-1的流速進(jìn)樣3 min，觀察響應(yīng)值，看是否有結(jié)合。每次進(jìn)樣結(jié)束后，用Glycin-HCl(pH 3.0)再生30 s。

1.2.5 動力學(xué)測定 首先，將RGD樣品在HBS-EP緩沖液中稀釋至500、250、125、62.5、31.25 μg·mL-1的系列濃度。然后，以最大稀釋量開始，以最小稀釋量結(jié)束，分別在整聯(lián)蛋白固定表面和參考表面以30 μL·min-1的流速注射稀釋的RGD樣品3 min。最后，停止注射RGD樣品，觀察其在5 min內(nèi)的解離率，在此期間芯片上只通過HBS-EP緩沖液。每個濃度的測定設(shè)置2個循環(huán)，在每個結(jié)合循環(huán)后，以30 μL·min-1的注射速度注入Glycin-HCl(pH 3.0)，對芯片表面進(jìn)行再生。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 將所得的實時SPR傳感圖導(dǎo)入Biaevaluation 分析軟件，選擇1∶1 Lamgmuir 結(jié)合模型進(jìn)行局部擬合。

2 結(jié) 果

2.1 芯片表面預(yù)濃縮-偶聯(lián)pH的選擇

通過Biacore 3000生物傳感器信號響應(yīng)值的變化，根據(jù)預(yù)濃縮得到的結(jié)果選擇最合適的偶聯(lián)pH。結(jié)果表明，整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)、αv亞基胞外區(qū)和β6亞基胞外區(qū)均在pH4.0的偶聯(lián)緩沖液中與芯片表面產(chǎn)生最佳的靜電相互作用。

2.2 在CM5芯片上偶聯(lián)整聯(lián)蛋白

通過蛋白固定自動化氨基偶聯(lián)程序，最終得到樣品蛋白的實際偶聯(lián)量：整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)為13 333.3 RU、αv亞基胞外區(qū)為15 000.8 RU、β6亞基胞外區(qū)為10 000.6 RU。

2.3 結(jié)合試驗與動力學(xué)測定

結(jié)合試驗RU值表明RGD溶液與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)和αv亞基胞外區(qū)有結(jié)合，且在低濃度下結(jié)合量少，在高濃度下結(jié)合量多，而RGD與β6亞基胞外區(qū)在兩種濃度下均基本沒有結(jié)合。由動力學(xué)曲線RU值可知，隨著反應(yīng)質(zhì)量濃度的增加，結(jié)合信號也逐漸升高，說明結(jié)合量增大，且都表現(xiàn)為快結(jié)合快解離(圖1)。采用 1∶1 Lamgmuir 結(jié)合模型擬合曲線，得到RGD基序與豬源整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和αv亞基胞外區(qū)的結(jié)合動力學(xué)常數(shù)(表1)。由平衡解離常數(shù)可知，RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的親和力比與整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的親和力高。

a.整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)；b.整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)a. αvβ6 extracellular domain; b. αv subunit extracellular domain圖1 RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)和整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)的結(jié)合動力學(xué)曲線Fig.1 kinetic curves of RGD motif binding to the αvβ6 extracellular domain and αv subunit extracellular domain

表1 RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)和整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)相互作用的動力學(xué)常數(shù)Table 1 Kinetic constants of the interaction between the RGD motif and the αvβ6 extracellular domain and αv subunit extracellular domain

3 討 論

FMDV通過細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主，這一過程是由病毒與細(xì)胞表面受體(主要是整聯(lián)蛋白)的結(jié)合啟動的[18]。研究證實，在體外病毒通過結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的RGD基序與細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)內(nèi)化[19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，形成FMDV病毒顆粒的衣殼蛋白中氨基酸殘基的變化不僅會影響病毒與細(xì)胞受體之間的吸附能力，還可能影響病毒的生物學(xué)特性[7，20-22]。

本研究結(jié)果表明，RGD基序與整聯(lián)蛋白β6亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域之間幾乎沒有結(jié)合；RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的親和力最強，平衡解離常數(shù)KD為7.33×10-6M；與整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域之間的親和力小于與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的親和力，平衡解離常數(shù)KD為9.79×10-5M。結(jié)合常數(shù)表明RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合速度快于與αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合速度。同時，動力學(xué)曲線表明，RGD基序與整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和整聯(lián)蛋白αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合過程均為快結(jié)合快解離，有部分原因可能是由于本試驗使用的RGD基序缺少上下游氨基酸，同時在體外整聯(lián)蛋白構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致結(jié)合不穩(wěn)定。

分子模擬FMDV RGD結(jié)構(gòu)域的氨基酸與整聯(lián)蛋白氨基酸之間可能的相互作用，發(fā)現(xiàn)RGD結(jié)構(gòu)域的精氨酸(Arg143)與家牛α-整聯(lián)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(SIPLQ)的亮氨酸(Leu679)相互作用，除此之外其他氨基酸之間也存在相互作用，如FMDV與β-整聯(lián)蛋白之間的其他相互作用包括Asn47-Gln1710、Arg152-Asn1643、Gly202-Gln1187和 Ser154-Lys1669；對不同牛種α-整聯(lián)蛋白外顯子區(qū)體外擴(kuò)增的研究表明，嗜性位點(SIPLQ)具有保守性[23]。在本研究中并未得到RGD基序與整聯(lián)蛋白β6亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合能力，可能是由于本研究中使用的是單一的Arg-Gly-Asp3肽，并沒有RGD上下游的氨基酸，因此，并沒有體現(xiàn)出與上述研究報道相似的結(jié)果。有研究表明，F(xiàn)MDV VP1衣殼蛋白中GH環(huán)的RGD序列可與細(xì)胞整聯(lián)蛋白形成極其穩(wěn)定的復(fù)合物，并且該復(fù)合物對EDTA具有抗性，特定氨基酸的替換表明，與αvβ6結(jié)合的穩(wěn)定性取決于靠近RGD序列的螺旋結(jié)構(gòu)，RGD +1和RGD +4位點的兩個亮氨酸殘基是這種穩(wěn)定相互作用的關(guān)鍵位置[24]。

此外，有研究報道，整聯(lián)蛋白對RGD基序的特異性識別是通過α亞基β螺旋槳結(jié)構(gòu)域與精氨酸結(jié)合，天冬氨酸通過Mg2+或Mn2+在金屬離子結(jié)合位點(MIDAS)與整聯(lián)蛋白β亞基β1結(jié)構(gòu)域結(jié)合[25-26]。本研究的樣品中并沒有加入Mg2+或Mn2+等金屬離子。研究證實，整聯(lián)蛋白β亞基βI結(jié)構(gòu)域含有多個二價金屬陽離子結(jié)合位點(MIDAS、ADMIDAS、LIMBS)，配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合受到二價金屬陽離子的調(diào)節(jié)，二價金屬陽離子(Ca2+、Mg2+和Mn2+)不僅是整聯(lián)蛋白與配體結(jié)合的前提，而且還可以影響整聯(lián)蛋白的激活狀態(tài)[17，27]，同時，二價金屬陽離子對配體與αv整聯(lián)蛋白上RGD位點結(jié)合的影響在同一配體的整聯(lián)蛋白和同一整聯(lián)蛋白的配體之間變化[28]。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明FMDV與宿主細(xì)胞整聯(lián)蛋白受體的相互作用機(jī)制提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

利用SPR技術(shù)從動力學(xué)角度實時分析了RGD基序分別與豬源整聯(lián)蛋白αvβ6胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域、αv亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和β6亞基胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的相互作用，通過數(shù)據(jù)擬合分析得到特異性相互作用的動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果表明，SPR技術(shù)能夠?qū)崟r、快速地檢測相互作用過程。