李少晗，由欣月，范君文，徐 一，郝雲(yún)峰，崔尚金，秦 彤*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2. 獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測(cè)站，北京 100193； 3. 北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；4. 中國(guó)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，北京 100125)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的，以出血性腸炎和心肌炎為主要特征的犬病毒性傳染病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是危害犬類的重要傳染病之一。CPV是一種無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈DNA病毒，其基因組編碼兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)[1]。VP2是CPV主要的衣殼蛋白，抗原性較強(qiáng)，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體，且在決定病毒的宿主范圍和組織趨向性方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。NS1蛋白具有ATP酶和解旋酶的功能，能夠調(diào)控其他蛋白的表達(dá)，且與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過程具有密切聯(lián)系[4-5]，目前，對(duì)NS1基因的研究還不夠充分。

最初的CPV-2型在鑒定后不久就開始產(chǎn)生抗原變異。1978年，兩個(gè)新型抗原突變體出現(xiàn)：CPV-2a和CPV-2b型，與CPV-2相比，CPV-2a的VP2包含了5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr、Val555Ile)；1984年，另一個(gè)突變體CPV-2b被發(fā)現(xiàn)，其VP2發(fā)生Asn426Asp和Ile555Val兩個(gè)位點(diǎn)的突變[6]。隨后，CPV-2a和CPV-2b VP2基因發(fā)生Ser297Ala的突變，產(chǎn)生了New CPV-2a和New CPV-2b變異株[7-8]；2000年，在意大利首次報(bào)道了另一種新穎的抗原變體，其特征是Asp426Glu，遂命名為CPV-2c[9]，并快速在多個(gè)國(guó)家傳播流行。相對(duì)于最初的CPV-2，抗原突變體CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c對(duì)犬的致病性更高，且病毒的宿主范圍不斷擴(kuò)大[10]。

本研究從北京地區(qū)采集的犬糞便拭子成功分離鑒定到14株CPV毒株，并對(duì)其VP2和NS1基因進(jìn)行序列分析，以期了解北京地區(qū)當(dāng)前CPV的流行趨勢(shì)，為控制該病的傳播提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

從北京地區(qū)寵物醫(yī)院收集了17份疑似細(xì)小病毒感染的犬糞便拭子，樣品信息見表1。將糞便拭子置于1 mL含10%甘油的PBS(pH 7.2)中，待PBS渾濁后，于4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心10 min，取200 μL上清液用0.22 μm濾器過濾除菌，制備好的樣品于-20 ℃保存，用于病毒DNA的提取。

表1 臨床樣品采集的詳細(xì)信息Table 1 Details of the isolated CPV strains

1.2 DNA提取及PCR鑒定

采用艾德萊公司的DNA快速提取試劑盒提取樣本DNA。根據(jù)VP2基因保守序列設(shè)計(jì)引物，序列：IdenP1：5′-TGATGGAGCAGTTCAACCAGA-3′，IdenP2：5′-TCAGATCTCATAGCTGCTGGA-3′，擴(kuò)增片段大小為574 bp。引物由北京華大基因公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，IdenP1、IdenP2各1 μL，DNA模板2 μL， ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 病毒的分離及鑒定

經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的樣本用于病毒的分離。將樣品上清液接種至剛剛傳代未貼壁的F81細(xì)胞懸液中，吹打混勻后，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔12 h觀察細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)CPE達(dá)到80%時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，對(duì)病毒進(jìn)行傳代。待CPE穩(wěn)定后，按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。并進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)鑒定。

1.4 分離毒株VP2、NS1全基因的擴(kuò)增及克隆

利用提取的樣本DNA，對(duì)VP2、NS1全基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大?。篤P2基因1 755 bp，NS1基因2 007 bp。 引物序列：VP2-F：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′，VP2-R: 5′-GG-AATTCTTAGTATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3′；NS1-F：5′-GACCGTTACTGACATTCGC-3′，NS1-R: 5′-CGGCGTCAGAAGGGTT-3′。PCR反應(yīng)體系：LATaq酶0.5 μL，10×LA BufferⅡ 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。將擴(kuò)增的VP2和NS1基因克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)中，并送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 分離毒株VP2、NS1基因的遺傳進(jìn)化分析

使用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并根據(jù)VP2基因中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)分離毒株進(jìn)行基因型鑒定。從GenBank中檢索來自世界各地的29個(gè)細(xì)小病毒序列，在Mega 6.0中使用最大似然法評(píng)估VP2和NS1的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(重復(fù)數(shù)n=500)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離鑒定

經(jīng)PCR鑒定，17份臨床病料為CPV陽(yáng)性。將病料接種F81細(xì)胞，盲傳3代后，14株毒株能夠引起典型的CPE，PCR和IFA檢測(cè)均為陽(yáng)性(圖略)，成功分離到14株CPV，分離株在F81細(xì)胞上生長(zhǎng)良好，病毒滴度為106.19～106.76TCID50·mL-1(表1)。

2.2 CPV基因型的鑒定及VP2基因氨基酸位點(diǎn)的突變分析

獲得14個(gè)毒株NS1和VP2基因完整ORF序列，426位氨基酸的突變被用來區(qū)分CPV-2a (426Asn)、CPV-2b (426Asp)和CPV-2c (426Glu)，297位氨基酸的差異用來區(qū)分CPV-2a/2b與New CPV-2a/2b(Ser297Ala突變被用作“New CPV-2a/2b”的標(biāo)記)[8, 11]。14個(gè)CPV毒株中，7株為New CPV-2a亞型(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-2、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-6、CPV-BJ02-1、CPV-BJ02-3、CPV-BJ02-4)，7株為CPV-2c亞型(CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7)，未發(fā)現(xiàn)CPV-2a、CPV-2b或New CPV-2b亞型的毒株。

VP2蛋白共有6個(gè)突變的氨基酸位點(diǎn)(第5、13、370、426、440、574位)，其中,僅有1樣本(CPV-BJ01-9)在第5位和13位氨基酸發(fā)生突變(第5位：A→G，13位P→S)，有4個(gè)樣本(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-1)在第574位 發(fā)生E→K氨基酸突變；此外，VP2基因上15個(gè)核苷酸發(fā)生同義突變，對(duì)氨基酸序列沒有影響。這些結(jié)果表明，少數(shù)氨基酸突變(殘基5、370和440)被保存下來，隨著CPV不斷傳播，新的氨基酸突變(13和574 aa)頻繁發(fā)生。

2.3 NS1氨基酸位點(diǎn)的突變分析

NS1出現(xiàn)12個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(第19、33、60、293、544、545、572、583、588、624、630、656位)，其中，第19、33、293、583、588、656位氨基酸僅發(fā)生1次突變(CPV-BJ02-6毒株第19位：K→R，CPV-BJ01-10毒株第33位：D→G，CPV-BJ01-9毒株第293位：V→F，CPV-BJ01-2毒株第583位：E→K，CPV-BJ02-4毒株第588位：S→N，CPV-BJ01-6毒株第656位：S→F)。另外，NS1基因上28個(gè)核苷酸突變?yōu)橥x突變，對(duì)氨基酸序列沒有影響。

2.4 VP2、NS1基因的遺傳進(jìn)化分析

VP2基因進(jìn)化分析表明，大部分的CPV-2c亞型毒株(CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-7、CPV-BJ01-5、CPV-BJ02-2、CPV-BJ01-10)與2016年廣西南寧地區(qū)分離毒株(MK332001、MK332007)親緣關(guān)系密切，CPV-BJ01-9株與2014年吉林地區(qū)分離株(KT162005)親緣關(guān)系密切，另外1株(CPV-BJ02-6)與2014年黑龍江分離毒株(KT156832)親緣關(guān)系密切，分離毒株與國(guó)外毒株明顯分離(圖1)；大部分的new CPV-2a亞型毒株(CPV-BJ02-1株除外)均與廣西南寧或吉林長(zhǎng)春地區(qū)的分離株聚集在一起，說明本次分離毒株與廣西或吉林地區(qū)分離毒株具有相同的起源。NS1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，雖然14個(gè)毒株分別屬于New CPV-2a和CPV-2c亞型，但它們的NS1基因都與New CPV-2a毒株親緣關(guān)系較近(圖2)。

圖1 犬細(xì)小病毒VP2基因的遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Maximum-likelihood tree based on VP2 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)

圖2 犬細(xì)小病毒NS1基因的遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Maximum-likelihood tree based on NS1 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)

3 討 論

盡管疫苗已廣泛應(yīng)用，犬細(xì)小病毒仍是目前危害犬最重要的腸道病原之一，因此，進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)具有重要意義。對(duì)NS1和VP2基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，除了已有報(bào)道的突變位點(diǎn)外，本研究首次發(fā)現(xiàn)了NS1基因上第19、33、293、588、624、656位氨基酸的突變，以及VP2基因上兩個(gè)新的突變位點(diǎn)(13和574 aa)。這可能歸因于新的選擇壓力，隨著CPV的傳播NS1、VP2基因仍在不斷地發(fā)生突變，未來有可能會(huì)出現(xiàn)新的毒株。然而，這些突變位點(diǎn)是否與NS1、VP2發(fā)揮功能有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

在基因系統(tǒng)進(jìn)化分析中，雖然14個(gè)毒株分別屬于New CPV-2a和CPV-2c，但是它們的NS1基因都與New CPV-2a毒株親緣關(guān)系密切，這一現(xiàn)象可用于解釋New CPV-2a和CPV-2c之間的重組?；旌细腥竞瓦B續(xù)的單向鏈置換復(fù)制機(jī)制可能有助于重組的發(fā)生[12]。從VP2和NS1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析可以得出兩個(gè)結(jié)論：1)即使VP2基因相同，NS1基因也可能不同。即擁有相同VP2基因序列的兩種病毒不一定是同一株病毒；這可以解釋CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-7和CPV-BJ01-8之間的關(guān)系，CPV-BJ01-1和CPV-BJ02-3之間的關(guān)系，CPV-BJ01-6和 CPV-BJ02-4以及CPV-BJ01-5和 CPV-BJ01-10之間的關(guān)系；2)可能CPV毒株VP2基因間關(guān)系不能完全代表NS1基因間的關(guān)系。例如，從VP2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析來看，CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7 7個(gè)毒株雖屬于CPV-2c型，但其NS1基因卻與New CPV-2a親緣關(guān)系密切，造成這種差異的原因尚不完全清楚，但選擇壓力或重組可能有助于解釋VP2和NS1相互沖突的系統(tǒng)發(fā)育樹。對(duì)于病毒來說，表面抗原和內(nèi)部抗原經(jīng)歷的選擇壓力不同，所以VP2比NS1的變異頻率更快。因此，病毒頻繁變異可能是逃避宿主免疫監(jiān)視的重要因素[13]。

4 結(jié) 論

成功分離鑒定到14株CPV毒株，New CPV-2a和CPV-2c型各7株?；蛐蛄蟹治霰砻鱊S1、VP2基因仍在不斷產(chǎn)生新的突變。分離毒株與廣西或吉林地區(qū)分離毒株可能具有相同的起源。