楊振興，謝佳芮，李占鴻，李卓然，廖德芳，牛保生，姚萍芬，李 樂(lè)*，楊 恒*

(1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.云南省師宗縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，曲靖 655700)

環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)病毒廣泛分布于熱帶、亞熱帶與溫帶地區(qū)，病毒主要通過(guò)庫(kù)蠓、蜱、蚊、白蛉等吸血昆蟲對(duì)動(dòng)物的叮咬傳播，可感染人、反芻動(dòng)物、馬屬動(dòng)物、有袋目哺乳動(dòng)物、蝙蝠以及鳥類等多種動(dòng)物并引發(fā)相關(guān)疾病，給家畜的養(yǎng)殖以及人類的公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重的威脅[1-2]。庫(kù)蠓(Culicoidesspp.)作為環(huán)狀病毒屬病毒重要的傳播媒介之一，可傳播包括藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus, BTV)[3]、非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)[4]和流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)[5]在內(nèi)的多種環(huán)狀病毒屬病毒，引起動(dòng)物的急性出血性疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。以BTV為例，2006年，北非來(lái)源的BTV血清8型毒株侵入荷蘭，隨后迅速蔓延至歐洲大部分國(guó)家，導(dǎo)致大量綿羊感染發(fā)病死亡，給歐洲各國(guó)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6]。近年來(lái)，EHDV血清6型與血清7型毒株相關(guān)疫病在以色列、土耳其、日本等地的牛群中暴發(fā)，引起了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的高度重視[7-8]。

環(huán)狀病毒屬隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，病毒的基因組大小約21 kb，含有10個(gè)基因節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)，依基因節(jié)段的大小分別命名為Seg-1(約3.9 kb)至Seg-10(約0.8 kb)。病毒粒子呈現(xiàn)二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，大小在60～80 nm[9]，結(jié)構(gòu)上分為外層衣殼、內(nèi)層衣殼與內(nèi)部核心3部分[10]。病毒內(nèi)層衣殼上的T2蛋白在環(huán)狀病毒屬的不同種病毒之間高度保守，對(duì)T2蛋白氨基酸的分析是鑒定環(huán)狀病毒屬不同種病毒的重要依據(jù)之一[11]。環(huán)狀病毒屬病毒的外層衣殼蛋白OC1具有高度變異性，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的主要蛋白，決定著病毒的血清型[12]。由于OC1蛋白高度變異的特性，導(dǎo)致環(huán)狀病毒屬病毒往往具有多種血清型，例如BTV已確認(rèn)了28種不同血清型[13]，EHDV已發(fā)現(xiàn)了10種血清型[14]，ASHV已分離出9種血清型[15]。

2012年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on the Taxonomy of Virues, ICTV)對(duì)已發(fā)現(xiàn)的22種環(huán)狀病毒屬病毒進(jìn)行了認(rèn)定[16]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)環(huán)狀病毒屬病毒的深入研究，不斷有新型環(huán)狀病毒被從媒介昆蟲與感染動(dòng)物上分離發(fā)現(xiàn)，例如：Bukakata orbivirus[17]、Mobuck orbivirus[18]、Skunk River virus、Kundal virus[19]、云南環(huán)狀病毒(Yunnan orbivirus)[20]、廣西環(huán)狀病毒(Guangxi orbivirus)[21]、西藏環(huán)狀病毒(Tibet orbivirus)[22]等。這些發(fā)現(xiàn)拓展了人們對(duì)環(huán)狀病毒屬病毒多樣性的認(rèn)識(shí)，為研究環(huán)狀病毒屬病毒的起源提供了基礎(chǔ)，因此掌握新的環(huán)狀病毒流行特征、致病性與感染宿主范圍在動(dòng)物疫病防控與保障公共衛(wèi)生安全等方面具有重要的意義。

2009年，從我國(guó)西藏的墨脫縣采集的蚊子標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)一種新型環(huán)狀病毒(XZ0906)，將其命名為西藏環(huán)狀病毒(TIBOV)[22]。隨后在廣東省豐開縣采集的致倦庫(kù)蚊和湖南采集的三帶喙庫(kù)蚊分別分離到TIBOV毒株(D181/2008和HN11121)[23]，2012和2013年，在云南省芒市與西雙版納采集的庫(kù)蠓樣本中分離到2株TIBOV(DH13C12和YN12246)[24-25]。通過(guò)分析決定TIBOV血清型的OC1蛋白的氨基酸序列，將發(fā)現(xiàn)的TIBOV分為兩種不同的血清型。在采集的牛、羊與豬等動(dòng)物的血清樣本中檢測(cè)到TIBOV的中和抗體，提示TIBOV可感染多種家畜，是一種潛在致病性病原[24]。2019年，作者在云南省師宗縣進(jìn)行庫(kù)蠓采集與蟲媒病毒分離，結(jié)果顯示在庫(kù)蠓上分離到1株新血清型TIBOV，本研究對(duì)病毒的分離、鑒定與初步的流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞株和毒株

一步法RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑RNAiso-Plus、逆轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript Ⅱ Reverse Transcriptase、DNA膠回收試劑盒、pMD19-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、高分辨率瓊脂糖等購(gòu)自大連寶生物公司；Q5超保真DNA聚合酶與T4 RNA連接酶購(gòu)自NEB公司；RNA純化試劑盒MicroElute RNA Clean Up購(gòu)自O(shè)MEGA公司；磁珠法病毒RNA抽提試劑盒、新生牛血清、MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo公司；白伊蚊細(xì)胞(Aedesalbopictus, C6/36)和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney, BHK-21)，BTV-1型毒株(Y863)、EHDV-1型毒株(V128/2014)與CHUV毒株(SZ187)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 庫(kù)蠓的采集

2019年8月，用光催化誘蟲燈在云南省師宗縣五龍壯族鄉(xiāng)(E104°29′, N24°63′)的牛舍和羊舍等環(huán)境中采集吸血昆蟲標(biāo)本。采集的標(biāo)本-20 ℃冰箱凍存處理30 min后，用篩孔尺寸為4 ～5 mm的金屬篩網(wǎng)進(jìn)行昆蟲的初步篩選，收集過(guò)篩的昆蟲，放入0 ℃的冰盒中當(dāng)日送往實(shí)驗(yàn)室，在體視顯微鏡下對(duì)庫(kù)蠓進(jìn)行篩選，并按照采集地點(diǎn)分裝于2.0 mL 的EP管中(200只·批-1)，并置于液氮灌中保存。

1.3 病毒分離

取凍存的庫(kù)蠓樣本，加入1 mL含雙抗(青霉素：100 U·mL-1，鏈霉素：0.1 mg·mL-1)的PBS洗滌蟲體 1 次，離心棄上清，加入1 mL含雙抗的MEM，放入多功能樣品均質(zhì)器TissueLyser II(Qiagen公司)中，選擇頻率30 次·s-1，研磨15 s，間隔5 s程序進(jìn)行勻漿。將勻漿后的樣本于4 ℃ 12 000 g·min-1離心20 min，吸取400 μL上清液分別接種于長(zhǎng)成單層的C6/36和BHK-21細(xì)胞，置28和37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中，感作1 h。孵育結(jié)束后，加入含2%牛血清和1%雙抗的MEM培養(yǎng)7 d，并分別在兩種細(xì)胞上連續(xù)盲傳3～4代。若接種細(xì)胞出現(xiàn)規(guī)律的CPE，凍融細(xì)胞2次，離心收集上清，對(duì)病毒分離物進(jìn)行編號(hào)，-80 ℃ 保存。

1.4 核酸提取及病毒核酸檢測(cè)

使用磁珠法病毒RNA抽提試劑盒，按說(shuō)明書提取病毒分離物的核酸。將提取的核酸95 ℃加熱3 min，并迅速置冰上進(jìn)行冷卻。使用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的BTV、EHDV、AHSV、阿卡斑病毒(AKAV)和帕利亞姆血清群病毒(PALV)等病毒群特異性引物(表1)進(jìn)行RT-PCR鑒定，同時(shí)設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

表1 用于鑒定本研究分離病毒的引物Table 1 Primers used to identify the viruses isolated in this study

1.5 病毒基因組dsRNA的提取與電泳觀察

與我國(guó)分離的BTV-1(Y863)、EHDV-1(V128/2014)和CHUV(SZ187)做對(duì)照，將病毒分別接種BHK-21細(xì)胞(75 cm2細(xì)胞瓶培養(yǎng))，待細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE后，離心收集細(xì)胞，RNAiso-Plus方法提取總RNA。按Attoui等[26]報(bào)道的方法，在提取的總RNA中加入等體積4 mol LiCl對(duì)宿主ssRNA進(jìn)行離心去沉淀，在上清中加入無(wú)水乙醇沉淀病毒的基因組dsRNA。以高分辨率瓊脂糖配制2%濃度的凝膠，取10 μL純化后的病毒基因組dsRNA于4 ℃以90 V 電壓電泳2～3 h， 比較分析待測(cè)病毒同BTV、EHDV和CHUV等3種病毒基因組dsRNA在瓊脂糖凝膠上的電泳帶型。

1.6 病毒粒子觀察

將病毒接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，出現(xiàn)60%～70% CPE后刮下細(xì)胞，8 ℃ 3 500 r·min-1離心30 min，棄上清，沉淀用PBS懸浮后，超聲波處理3次，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液滴加在覆有Formver膜的銅網(wǎng)上，約3 min用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體，將銅網(wǎng)放入2%磷鎢酸(pH 7.2)中負(fù)染5 min，用濾紙吸去多余的染色液，室溫風(fēng)干后進(jìn)行透射電鏡拍照分析，觀察病毒粒子結(jié)構(gòu)特征。

1.7 Seg-2與Seg-3克隆測(cè)序

取純化后的病毒基因組dsRNA參照Maan等[27]報(bào)道的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增技術(shù)(full-length amplification of cDNAs, FLAC)進(jìn)行病毒的全基因組cDNA合成。使用Q5超保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)。電泳檢測(cè)病毒基因組PCR擴(kuò)增情況，膠回收Seg-2和Seg-3片段，并與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp的LB平板，挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性菌落送測(cè)序。

1.8 病毒序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用序列拼接軟件CExpress對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，使用NCBI網(wǎng)站中的在線ORF分析軟件進(jìn)行Seg-2與Seg-3基因節(jié)段的ORF區(qū)分析。通過(guò)Mafft-win軟件[28]比對(duì)從GenBank中下載的其他環(huán)狀病毒屬代表毒株序列與本研究中毒株基因組序列后，用BioEdit軟件進(jìn)行核酸和氨基酸序列相似度計(jì)算。使用MEGA 6.0軟件[29]對(duì)對(duì)比后的氨基酸序列進(jìn)行模型選擇及最大似然樹(maximum-likelihood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)生樹中的其他國(guó)家分離的毒株序列以“GenBank序列號(hào)_病毒”表示，本研究中獲取的毒株以黑色三角表示。

1.9 當(dāng)?shù)丶倚蟮腡IBOV抗體檢測(cè)

2019年8月，在師宗縣五龍壯族鄉(xiāng)分別采集黃牛和山羊全血40和68份，分離血清后，使用中和試驗(yàn)進(jìn)行TIBOV抗體檢測(cè)。采用Karber法測(cè)定分離毒株的TCID50，將病毒液稀釋至100 TCID50備用。將待測(cè)血清進(jìn)行倍比梯度稀釋(1∶10～1∶1 280)， 加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50 μL·孔-1)，加入100 TICD50的病毒懸液(50 μL·孔-1)，充分混勻后37 ℃ 5% CO2條件下孵育1 h。在細(xì)胞板中加入BHK-21細(xì)胞懸液(100 μL·孔-1)，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，逐日觀察細(xì)胞病變，并計(jì)算抗體效價(jià)(抗體效價(jià)<1∶10判定為陰性，抗體效價(jià)≥1∶10判定為陽(yáng)性)。

2 結(jié) 果

2.1 庫(kù)蠓的采集與鑒定

2019年8月，在云南省師宗縣五龍壯族鄉(xiāng)的牛舍中采集庫(kù)蠓約1 600只，羊舍中采集庫(kù)蠓約1 200只，按照采集地點(diǎn)200只·批-1分裝于2.0 mL的管中，置液氮灌中保存，直至分離病毒時(shí)取出。

2.2 病毒分離

將研磨處理后的庫(kù)蠓樣本分別接種C6/36和BHK-21細(xì)胞后連續(xù)盲傳3代，最終獲得3株能引起細(xì)胞規(guī)律病變的分離物，其中,2株病毒分離物(YNSZ/V291/2019和YNSZ/V292/2019)接種C6/36細(xì)胞病變不明顯，接種BHK-21細(xì)胞72～96 h后，細(xì)胞出現(xiàn)圓縮和脫落。1株病毒分離物(YNSZ/V290/2019)接種C6/36和BHK-21后均可引起明顯的細(xì)胞病變(圖1)，接種BHK-21細(xì)胞24 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的圓縮，48 h后開始大量脫落；接種C6/36細(xì)胞48 h后細(xì)胞開始出現(xiàn)部分圓縮，72 h后細(xì)胞才開始大量出現(xiàn)圓縮和脫離。

A、B、C和D分別表示YNSZ/V290/2019接種BHK-21細(xì)胞24、48、72和96 h后的細(xì)胞狀態(tài)；F、G、H和I分別表示YNSZ/V290/2019接種C6/36細(xì)胞24、48、72和96 h后的細(xì)胞狀態(tài)；E、J分別表示96 h后的BHK-21和C6/36細(xì)胞對(duì)照A, B, C and D indicate the cell state of BHK-21 cells after YNSZ/V290/2019 strain-infected 24, 48, 72 and 96 h，respectively; F, G, H and I indicate the cell state of C6/36 cells after YNSZ/V290/2019 strain-infected 24, 48, 72 and 96 h， respectively; E, J indicate uninfected BHK-21 and C6/36 control cells at 96 h， respectively圖1 YNSZ/V290/2019接種BHK-21和C6/36細(xì)胞后能引起CPE(100×)Fig.1 Cytopathic effect of YNSZ/V290/2019 isolates on BHK-21 and C6/36 cells (100×)

2.3 病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果

提取3株病毒分離物的核酸，分別使用EHDV、BTV、PALV、AKAV和AHSV鑒定引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。YNSZ/V291/2019和YNSZ/V292/2019毒株鑒定為EHDV，而YNSZ/V290/2019毒株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.4 高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分析

提取并純化待鑒定的YNSZ/V290/2019、BTV-1(Y863)、EHDV-1(V128/2014)和CHUV(SZ187)毒株的基因組dsRNA，以2%的高分辨率瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2顯示，YNSZ/V290/2019的dsRNA電泳帶型與BTV和EHDV的較相似，呈現(xiàn)出“3-3-3-1”電泳帶型，而CHUV的電泳帶型顯“3-3-4”的帶型特征?；蚪M電泳結(jié)果表明YNSZ/V290/2019為基因組分節(jié)段dsRNA病毒，且各基因節(jié)段大小與BTV和EHDV比較接近。

1.YNSZ/V290/2019；2.藍(lán)舌病病毒；3.流行性出血病病毒；4.中山病病毒1. YNSZ/V290/2019; 2. BTV; 3. EHDV; 4. CHUV圖2 dsRNA高分辨率瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 The high-resolution agarose gel electrophoresis result of genomic dsRNA

2.5 病毒粒子觀察

在電鏡下觀察YNSZ/V290/2019的病毒粒子形態(tài)特征，結(jié)果如圖3顯示：病毒形態(tài)呈球形，無(wú)囊膜，直徑55～75 nm，在病毒粒子表面可看見纖維狀突起，與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)狀病毒屬病毒形態(tài)特征較接近[24]。結(jié)合病毒基因組dsRNA電泳結(jié)果，提示分離的病毒很可能為環(huán)狀病毒屬病毒。

圖3 YNSZ/V290/2019的負(fù)染電鏡觀察(110 000×)Fig.3 Negative staining electron microscopy observation of YNSZ/V290/2019 virions (110 000× magnification)

2.6 病毒Seg-2與Seg-3的克隆測(cè)序

采用FLAC技術(shù)，通過(guò)克隆的方式獲取YNSZ/V290/2019毒株Seg-2與Seg-3基因片段，電泳顯示該毒株Seg-2與Seg-3的片段約為3 kb(圖4)。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的Seg-2、Seg-3 DNA長(zhǎng)度分別為2 820 和2 770 bp，G+C含量分別為40.03%和44.67%，均具有Kozak序列特征，編碼的OC1與T2蛋白氨基酸殘基數(shù)分別為922和899 aa。

1. Seg-2；2. Seg-3；M. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Seg-2; 2. Seg-3; M. DL5000 DNA marker圖4 YNSZ/V290/2019毒株Seg-2和Seg-3電泳圖Fig.4 Seg-2 and Seg-3 electrophoresis of YNSZ/V290/2019 strain

2.7 YNSZ/V290/2019毒株的鑒定

環(huán)狀病毒屬的T2蛋白具有高度保守性，同種病毒間氨基酸序列相似度>82%，因此，對(duì)該蛋白的氨基酸序列分析是鑒定環(huán)狀病毒屬不同種病毒最為重要的手段[19-22]。序列比對(duì)顯示(表2)，YNSZ/V290/2019的Seg-3/T2序列與TIBOV的序列相似度最高，核酸序列相似度為80.90%～81.70%，氨基酸序列相似度為97.20%～97.30%；與BTV、EHDV和Pata virus相似度較低，核酸和氨基酸序列相似度分別為68.90%～70.90%與75.80%～77.80%，表明分離的YNSZ/V290/2019毒株為TIBOV的一個(gè)成員。

為明確YNSZ/V290/2019與其他環(huán)狀病毒之間的進(jìn)化關(guān)系，筆者選擇已知的22種環(huán)狀病毒屬病毒T2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行ML樹的構(gòu)建，選擇的最優(yōu)進(jìn)化模型為L(zhǎng)G+G+F。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示(圖5)，環(huán)狀病毒屬病毒的T2聚為三簇，分別為庫(kù)蠓傳播環(huán)狀病毒(CBOs)，蜱傳播環(huán)狀病毒(TOBs)與蚊傳播環(huán)狀病毒(MOBs)。分離的YNSZ/V290/2019位于CBOs進(jìn)化分支，與已報(bào)道的TIBOV聚為一簇，與BTV、EHDV和Pata virus具有最近的親緣關(guān)系，這提示庫(kù)蠓很可能是TIBOV的主要傳播媒介。

2.8 YNSZ/V290/2019毒株OC1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

環(huán)狀病毒屬的外層衣殼蛋白OC1決定著病毒的血清型，由于該蛋白的高度變異特性，導(dǎo)致同一種環(huán)狀病毒往往存在眾多的血清型，當(dāng)決定同種環(huán)狀病毒血清型的OC1蛋白的氨基酸序列相似度<64%時(shí)，可判定為同種病毒的不同血清型[14]。目前，已知的TIBOV中存在兩種不同的血清型，分別以DH13C120毒株和XZ0906毒株為代表[22,24]，兩種血清型毒株Seg-2/OC1相似度最高分別為30.7%與42%。YNSZ/V290/2019的出現(xiàn)進(jìn)一步降低了不同血清型TIBOV毒株之間Seg-2/OC1的序列相似度，YNSZ/V290/2019與已知毒株的Seg-2核酸序列相似度在26.90%～30.60%，OC1蛋白氨基酸序列相似度在28.50%～33.20%，明顯<64%(表2)。同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)生樹上(圖6)，YNSZ/V290/2019形成了一個(gè)獨(dú)立于其他已知TIBOV的進(jìn)化分支，進(jìn)一步證實(shí)該毒株可能為一種新血清型的TIBOV。

表2 YNSZ/V290/2019毒株與環(huán)狀病毒屬病毒的核酸及氨基酸序列相似度Table 2 Nucleotide sequence and amino acid sequence similarity of YNSZ/V290/2019 with virus species of genus Orbivirus %

2.9 TIBOV中和抗體的檢測(cè)

為分析新血清型TIBOV(YNSZ/V290/2019)在動(dòng)物上的感染情況，筆者通過(guò)血清中和試驗(yàn)，對(duì)師宗縣采集的牛、羊血清進(jìn)行了初步調(diào)查。試驗(yàn)結(jié)果顯示，40份黃牛血清檢測(cè)9份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為22.50%，68份山羊血清檢測(cè)3份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為4.41%。上述結(jié)果說(shuō)明TIBOV(YNSZ/V290/2019)可感染牛、羊，且在牛上有著較高的感染率。

YNSZ/V290/2019 毒株以黑色三角表示，TIBOV毒株以方框顯示，樹圖節(jié)點(diǎn)的數(shù)值表示重復(fù)500次的自舉檢驗(yàn)可信值。感染蜱的環(huán)狀病毒St Croix River virus作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外類群。樹圖中不同種類的環(huán)狀病毒以“GenBank序列號(hào)_病毒名表示”。CBOs.庫(kù)蠓傳播環(huán)狀病毒；MBOs.蚊傳播環(huán)狀病毒；TBOs.蜱傳播環(huán)狀病毒YNSZ/V290/2019 was represented as black triangle, TIBOV was represented as black boxes, the number at nodes indicate bootstrap confidence 500 bootstrap replicates. St Croix River virus from infected tick was as out group. Different Orbivirus species were indicated as "GenBank accession number plus virus name", Culicoides-borne orbiviruses (CBOs), Mosquito-borne Orbiviruses (MBOs), and Tick-borneorbiviruses respectively (TBOs)圖5 YNSZ/V290/2019毒株T2蛋白ML系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.5 Maximum likelihood (ML) tree showing phylogenetic relationship of T2 proteins of YNSZ/V290/2019

3 討 論

云南省師宗縣平均海拔1 800～1 900 m，域內(nèi)河流眾多，森林覆蓋率47.11%，有亞熱帶與溫帶共存的氣候特征，終年溫和(年平均氣溫13.9 ℃)，無(wú)霜期達(dá)273 d，非常適宜媒介昆蟲的生存繁衍，蟲媒病毒種類眾多。1979年,張念祖等[30]在云南省師宗縣暴發(fā)藍(lán)舌病的綿羊中首次分離到BTV，確定了BTV在我國(guó)的存在。2012年至今，本實(shí)驗(yàn)室在師宗縣設(shè)立的哨兵動(dòng)物中先后分離到12種血清型的BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24)[31]、5種血清型的EHDV(EHDV-1、-5、-6、-7、-10)、 3種帕利亞血清群病毒(Palyam serogroup virus, PALV)[32]及多株阿卡斑病毒(Akabanevirus, AKAV)[33]。新血清型TIBOV(YNSZ/V290/2019)在師宗縣采集庫(kù)蠓上的分離，再次表明師宗縣蟲媒病毒的高度多樣性。筆者認(rèn)為該地區(qū)作為了解云南蟲媒病毒的一個(gè)窗口，值得進(jìn)一步進(jìn)行蟲媒病毒的長(zhǎng)期跟蹤調(diào)查。

YNSZ/V290/2019 毒株以黑色三角表示，TIBOV毒株以方框顯示，樹圖節(jié)點(diǎn)的數(shù)值表示重復(fù)500次的自舉檢驗(yàn)可信值。感染蜱的環(huán)狀病毒St Croix River virus作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外類群YNSZ/V290/2019 was represented as black triangle, TIBOV was represented as black boxes, and the number at nodes indicate bootstrap confidence 500 bootstrap replicates. St Croix River virus from infected tick was as out group圖6 YNSZ/V290/2019毒株OC1蛋白ML系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.6 Maximum likelihood (ML) tree showing phylogenetic relationship of OC1 proteins of YNSZ/V290/2019

2019年8月，從師宗縣的庫(kù)蠓上分離到1株分離物YNSZ/V290/2019，經(jīng)BTV、EHDV、PLAV、AKAV和AHSV的群特異性檢測(cè)，鑒定結(jié)果均為陰性，使對(duì)病毒的鑒定陷入困境。病毒基因組的瓊脂糖凝膠電泳、病毒粒子的電鏡觀察均為國(guó)際病毒分類委員會(huì)用于環(huán)狀病毒屬鑒定的重要參數(shù)之一。因此筆者提取YNSZ/V290/2019毒株的基因組進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示其基因組為雙鏈RNA，且電泳帶型特征與BTV和EHDV接近，因此，認(rèn)為YNSZ/V290/2019很可能為環(huán)狀病毒屬病毒。在電鏡下觀察，YNSZ/V290/2019的病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，病毒粒子表面分布大量纖維狀突起，形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)狀病毒屬病毒特征較接近[25]，進(jìn)一步明確了分離病毒的分類。

雖然病毒基因組電泳和電鏡觀察為鎖定YNSZ/V290/2019毒株為環(huán)狀病毒屬病毒提供了線索，但該毒株在環(huán)狀病毒屬病毒中的分類地位尚不明確。T2蛋白在環(huán)狀病毒屬病毒的同種病毒之間高度保守，因此對(duì)該蛋白的氨基酸序列分析是環(huán)狀病毒屬不同種病毒鑒定最為重要的參數(shù)，當(dāng)兩種環(huán)狀病毒屬病毒的T2蛋白氨基酸序列相似度>82%可判定為同一種環(huán)狀病毒[17-20]。YNSZ/V290/2019毒株和已知TIBOV的T2蛋白的氨基酸序列相似度>97%，在系統(tǒng)發(fā)生樹上與中國(guó)分離的TIBOV聚為一簇，獨(dú)立于其他環(huán)狀病毒屬病毒，證實(shí)了本研究分離的YNSZ/V290/2019為TIBOV的一員。

環(huán)狀病毒屬病毒可在其媒介體內(nèi)進(jìn)行增殖，因此環(huán)狀病毒屬病毒與媒介之間存在共進(jìn)化關(guān)系。在系統(tǒng)發(fā)生樹上，環(huán)狀病毒屬病毒高度保守的T2蛋白分為庫(kù)蠓傳播環(huán)狀病毒(CBOs)、蚊傳播環(huán)狀病毒(MBOs)與蜱傳播環(huán)狀病毒(TBOs)，這與病毒的天然傳播媒介完全吻合，從另一個(gè)側(cè)面也證實(shí)環(huán)狀病毒屬病毒對(duì)其傳播媒介的依存。在系統(tǒng)發(fā)生樹上，YNSZ/V290/2019與庫(kù)蠓傳播的BTV、EHDV、PALV等聚為一簇，表明了庫(kù)蠓是TIBOV的主要傳播媒介。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，TIBOV-1型XZ0906毒株與TIBOV-2型D181/2008毒株分離自蚊子，我們認(rèn)為很可能是蚊子叮咬了感染TIBOV動(dòng)物的血液，分離的病毒很可能是來(lái)自蚊子消化道中血液。TIBOV是否能在蚊子體內(nèi)增殖，仍需要調(diào)查研究。

環(huán)狀病毒屬的Seg-2/OC1決定病毒的血清型，通過(guò)Seg-2/OC1的序列分析，已發(fā)現(xiàn)我國(guó)流行的TIBOV存在兩種不同的血清型[24-25]。在我國(guó)西藏分離的TIBOV(XZ0906毒株)代表一種血清型，將其命名為TIBOV-1型；在我國(guó)云南與廣東省分離的TIBOV(DH13C120毒株與D181/2008毒株)代表著另一種血清型，將其命名為TIBOV-2型，TIBOV-1與TIOBV-2型之間OC1的序列相似度為42%。本試驗(yàn)分離的YNSZ/V290/2019與TIBOV-1和TIBOV-2血清型毒株的OC1最大相似度分別為33.20%與28.50%，在OC1的系統(tǒng)發(fā)生樹上YNSZ/V290/2019形成了獨(dú)立于TIBOV-1與TIBOV-2的獨(dú)立進(jìn)化分支，以上結(jié)果均表明該毒株代表著一種新血清型的TIBOV，將其命名為TIBOV-3。由于缺乏TIBOV-1至TIBOV-3等3種血清型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，不同血清型TIBOV之間是否存在交叉反應(yīng)尚難以進(jìn)行判定，該工作有待于后續(xù)研究中逐步完善。

對(duì)YNSZ/V290/2019感染范圍的初步調(diào)查結(jié)果顯示，黃牛和山羊血清中均存在TIBOV抗體，抗體陽(yáng)性率分別為22.50%和4.41%，表明牛和山羊均能被TIBOV感染，但在牛的病毒感染率更高。目前尚未見在動(dòng)物中分離TIBOV的報(bào)道，但筆者和他人的研究結(jié)果均顯示TIBOV在我國(guó)云南省的牛羊中有著較高的感染率，同時(shí)，在我國(guó)的云南、廣西、湖南與西藏采集的媒介中均分離出TIBOV[22-25]，表明TIBOV在我國(guó)很可能有著廣泛的分布，因此，該病毒的感染宿主范圍、感染率與致病性等方面的工作仍值得進(jìn)一步調(diào)查。在下一步工作中，將完成YNSZ/V290/2019毒株的全基因組測(cè)序工作，開發(fā)TIBOV的群特異性和血清型特異性qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)，開展TIBOV的分離、致病性與流行病學(xué)調(diào)查等方面的研究。

4 結(jié) 論

2019年，在師宗采集的庫(kù)蠓上分離到1株新型TIBOV(YNSZ/V290/2019)，Seg-3/T2序列與已知TIBOV的序列相似度最高(80.90%～81.70%/97.20%～97.30%)；Seg-2/OC1序列與已知TIBOV的序列相似度最低(26.90%～30.60%/28.50%～33.20%)，并且在OC1氨基酸ML樹上，YNSZ/V290/2019形成了一個(gè)獨(dú)立于其他已知TIBOV的進(jìn)化分支。中和試驗(yàn)顯示，師宗的黃牛和山羊血清中均存在TIBOV抗體，表明牛和山羊均能被TIBOV感染，但在牛的感染率更高。