王麗瑄, 周 群，付能勝，曹 慧，何欣怡，方鵬飛，胡承哲，張 斌,3*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2. 華派生物工程集團(tuán)有限公司，成都 610000；3.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041)

豬捷申病又稱塔爾凡病，是由豬捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)引起的豬脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、肺炎、痢疾、心包炎和心肌炎、皮膚破損等多種表現(xiàn)的病毒性傳染病[1-2]。PTV只能夠以豬作為宿主，隱性感染豬是非常重要的傳染源，目前，該病已成為全球養(yǎng)豬業(yè)重要傳染病之一[3-4]。2003年，哈爾濱獸醫(yī)研究所在我國內(nèi)蒙古自治區(qū)首次分離到了PTV[5]，目前，該病毒在我國多地已有報(bào)道[3]。

PTV在病毒分類學(xué)上屬于小RNA病毒科捷申病毒屬[6]，因廣泛存在于豬腸道內(nèi)而被歸類于豬腸道病毒[7]。病毒粒子為球形，無囊膜，直徑20～30 nm，內(nèi)部核心是單股正鏈RNA，長約7.2 kb，含有1個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，ORF經(jīng)蛋白酶切割加工后形成P1、P2和P3 3種多肽前體，其中，P1為衣殼蛋白的前體，經(jīng)過加工成熟后為PTV的衣殼蛋白；P2和P3均為非結(jié)構(gòu)蛋白的前體，成熟后形成一些中間前體產(chǎn)物，這些產(chǎn)物都非常穩(wěn)定，參與病毒復(fù)制的各項(xiàng)生命活動(dòng)[8]。P1區(qū)編碼VP1、VP2、VP3和VP4 4種結(jié)構(gòu)蛋白[9-11]。VP1是PTV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在VP1蛋白編碼基因區(qū)域中設(shè)計(jì)的引物適用于血清型分型的評(píng)估[11-12]，PTV已鑒定13種血清型，依據(jù)所有血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株的基因組序列，分別對(duì)應(yīng)PTV-1～PTV-13[13-14]，各個(gè)地區(qū)流行的血清型不同[15]。PTV存在同源重組現(xiàn)象，PTV重組大多發(fā)生在不同血清型之間[16-17]，也存在同種血清型之間的PTV重組[15]。據(jù)報(bào)道不同血清型毒株的毒力也存在差異，導(dǎo)致的臨床癥狀也不同。PTV-1的強(qiáng)毒株可導(dǎo)致嚴(yán)重的捷申病毒腦脊髓灰質(zhì)炎，PTV-1的其他弱毒株及其他血清型能引起溫和型或隱性感染[2]。為了初步調(diào)查四川藏豬PTV的流行情況及其分子特性，本研究對(duì)2017—2018年采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14個(gè)藏豬場共96份糞便樣本進(jìn)行了PTV的檢測，并對(duì)其全基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

KOD OneTMPCR Master Mix Blue和QuickTaqHS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DL2000TMDNA Marker購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；TGL-16冷凍離心機(jī)購自四川蜀科儀器有限公司；PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 病料采集與處理

病料為2017—2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市的14個(gè)藏豬場共96份豬糞便樣本，96份糞便樣本中50份為正常糞便樣本，46份為腹瀉樣本。按1∶5加入PBS震蕩混勻，反復(fù)凍融3次后，10 000 r·min-1離心5 min，取上清于-80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考報(bào)道的PTV檢測引物[18]進(jìn)行合成，序列如下，上游引物：5′-TGTTGTGTTTAAACACAGAAAT-3′，下游引物：5′-TTCAACTGACTATACAAAGTAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約238 bp。參考GenBank上已經(jīng)發(fā)表的13種PTV血清型全長基因組序列，根據(jù)保守區(qū)域，對(duì)20份PTV陽性的cDNA 進(jìn)行全基因的擴(kuò)增，使用DNAStar軟件分別設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PTV全基因擴(kuò)增引物Table 1 Whole gene amplification primers of PTV

1.4 核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

用Trizol法抽提樣本中總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。反應(yīng)體系：總RNA4 μL， 5×Buffer 2 μL，oligo (dT) 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藏豬腹瀉樣本中PTV陽性率的調(diào)查

以“1.3”中合成的PTV檢測引物對(duì)cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL， ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸8 min。

1.6 PTV全基因組序列的克隆及分析

用RT-PCR法對(duì)PTV全基因進(jìn)行分段擴(kuò)增，KOD OneTMPCR Master Mix Blue 12.5 μL， 上下游引物各1 μL，cDNA模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s、54 ℃/47 ℃/52 ℃/51 ℃/ 55 ℃/54 ℃/56 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循環(huán)35次。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化，按照pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。用DNAStar等分子生物學(xué)軟件，將序列拼接，取VP1基因分別與GenBank不同血清型PTV毒株的VP1進(jìn)行序列比對(duì)，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系，最終確定其血清型。

1.7 PTV重組分析

為了分析不同來源的PTV毒株之間的遺傳關(guān)系和重組關(guān)系，以RDP4軟件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法進(jìn)行重組分析，利用SimPlot程序?qū)γ總€(gè)簇分別進(jìn)行相似性分析，對(duì)重組區(qū)和非重組區(qū)構(gòu)建獨(dú)立的進(jìn)化樹以驗(yàn)證重組。

1.8 PTV分歧時(shí)間估算

以貝葉斯進(jìn)化分析軟件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序設(shè)置序列的采樣時(shí)間、氨基酸置換模型、分子鐘模型、馬爾科夫鏈長和先驗(yàn)參數(shù)。以BEAST程序運(yùn)算，通過MCMC方法進(jìn)行樹的重復(fù)抽樣，獲得具有最大后驗(yàn)概率的進(jìn)化樹。通過TreeAnnotator程序設(shè)置Burnin值。以FigTree v1.4.4軟件對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行修飾和分歧時(shí)間的標(biāo)定，分析病毒序列的演化過程。

2 結(jié) 果

2.1 PTV核酸陽性樣本檢出率

利用PTV檢測引物[18]，以RT-PCR方法對(duì)14個(gè)規(guī)模化藏豬場的96份糞便樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：在糞便樣本中，PTV核酸陽性率為20.8%(20/96，95%CI=13.2%～30.3%)；14個(gè)規(guī)模化藏豬場中，PTV豬場陽性率為57.1%(8/14，95%CI= 28.9%～82.3%)，結(jié)果表明PTV在藏豬中存在且流行。陽性樣本中腹瀉樣本為9份，正常樣本為11份，說明健康豬帶毒和隱性感染普遍存在。

2.2 兩株P(guān)TV全基因擴(kuò)增和序列分析

對(duì)20份PTV檢測陽性的樣本均進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增，最后獲得了2條近似全基因組序列，PTV SWU-E5-2018全基因組擴(kuò)增結(jié)果(圖2)。將序列命名并上傳至GenBank，分別為SWU-E5-2018(GenBank accession No. MT295503)、SWU-ZG2-2018 (No.MT295502)。SWU-E5-2018序列長度為6 760 bp，GC含量為44.3%；SWU-ZG2-2018序列長度為6 766 bp，GC含量為44.5%。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～24. 部分臨床樣品M. DNA marker; Lanes 1-24. Some clinical samples圖1 部分臨床樣本中PTV的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR assay of some clinical samples

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～7. 各引物片段擴(kuò)增結(jié)果M. DNA marker; Lanes 1-7. Amplification results of each primer fragment, respectively圖2 PTV SWU-E5-2018全基因組擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Complete genome amplification results of PTV SWU-E5-2018 strain

通過MEGA7.0對(duì)本研究中2條藏豬源PTV序列與49條參考序列進(jìn)行全基因組核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹分析(圖3A)。結(jié)果表明在核苷酸水平51條PTV全基因組序列可分為2個(gè)大的分支，血清1型、血清3型、血清10型和血清11型為一個(gè)大的分支；其他的血清型為一個(gè)大的分支。按進(jìn)化樹分析結(jié)果可知，SWU-E5-2018與HuN2親緣關(guān)系最近，SWU-ZG2-2018與HuN16親緣關(guān)系最近。運(yùn)用MegAlign進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明：2條PTV序列之間的全基因組核苷酸相似性為83.1%，與GenBank上已報(bào)道的69個(gè)毒株之間的全基因組核苷酸相似性為79.9%～91.3%。2條PTV序列之間ORF區(qū)的核苷酸相似性為82.8%，氨基酸序列相似性為86.3%；與GenBank上已報(bào)道的69株毒株之間ORF區(qū)核苷酸相似性為78.9%～91.2%，氨基酸序列相似性為82.8%～92.8%。為進(jìn)一步研究藏豬源PTV的分子特征，對(duì)2條PTV序列ORF區(qū)各基因進(jìn)行同源性分析(表2)，發(fā)現(xiàn)VP1基因的遺傳變異性較大，與NCBI中毒株相似性最低為60.8%。VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明(圖3B)，SWU-E5-2018屬于PTV-3血清型。與HuN2遺傳關(guān)系最近，其VP1核苷酸的相似性達(dá)到92.8%，氨基酸相似性達(dá)96.6%，與其他血清型的毒株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，核苷酸的相似性只有63.8%～75.7%。SWU-ZG2-2018屬于PTV-6血清型，與HuN16遺傳關(guān)系最近，其VP1核苷酸相似性為93.7%，氨基酸相似性達(dá)97.7%，與國內(nèi)PTV-6型毒株相似性為82.0%～89.9%，與德國PTV-6型Vir-3634/85株相似性為81.5%，與其他血清型毒株之間的核苷酸相似性為60.8%～80.1%。結(jié)果說明PTV不同血清型毒株之間VP1基因差異很大。

A為全基因遺傳進(jìn)化樹；B為VP1基因遺傳進(jìn)化樹，●為本研究序列A is the whole gene genetic evolutionary tree; B is the VP1 gene genetic evolutionary tree, ●stand for the sequences of this study圖3 2條PTV核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Genetic evolutionary tree of two PTV nucleotide sequences

表2 兩條PTV序列 ORF基因相似性Table 2 Gene homology of two PTV ORF sequences %

2.3 PTV重組分析

通過RDP4和SimPlot軟件對(duì)2條PTV序列全基因組進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示，SWU-E5-2018其衣殼蛋白P1片段中存在重組，選取重組序列SWU-E5-2018、親本序列JF613和一條序列JPN/Ishi-Im9/2016/G1，利用SimPlot軟件進(jìn)行相似性分析(圖4A)，以斷點(diǎn)位置為界，將SWU-E5-2018序列劃分成重組區(qū)域(552—3 082 bp)和兩個(gè)非重組區(qū)域(1—551 bp、3 083 bp—3′end)。通過MEGA 7.0軟件的Neighbour-Join法對(duì)3個(gè)區(qū)域的核苷酸序列分別構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4B、4C、4D)，基于重組區(qū)域構(gòu)建的進(jìn)化樹較非重組區(qū)域顯示出不一致的遺傳系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)一步支持了SWU-E5-2018中的重組事件。

A為 SimPlot 相似性分析結(jié)果；B為非重組區(qū)核苷酸構(gòu)建的進(jìn)化樹；C為重組區(qū)域構(gòu)建的進(jìn)化樹；D為非重組區(qū)域構(gòu)建的進(jìn)化樹A is the SimPlot similarity analysis result; B is the evolutionary tree constructed by the nucleotide in the non-recombinant region; C is the evolutionary tree constructed by the recombinant region; D is the evolutionary tree constructed by the non-recombinant region圖4 PTV全基因組重組分析Fig.4 Whole gene recombination analysis of PTV

2.4 PTV分歧時(shí)間的計(jì)算

為進(jìn)一步研究PTV的進(jìn)化過程，通過BEAST v1.8.0軟件對(duì)71條確定采樣時(shí)間的PTV全基因序列進(jìn)行分歧時(shí)間的估算。將fasta格式的序列導(dǎo)入BEAST軟件中，先用BEAUti程序處理序列生成XML格式文件，采用貝葉斯馬爾可夫鏈-蒙特卡羅(MCMC)算法進(jìn)行分析，通過BEAUti輸出模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、分支長度和核苷酸替換模型等參數(shù)進(jìn)行重復(fù)抽樣，得到穩(wěn)定的參數(shù)分布，輸出最大后驗(yàn)概率值的貝葉斯進(jìn)化樹，用FigTree軟件進(jìn)行展示(圖5)。估算出SWU-E5-2018 的分歧時(shí)間約為2010年，SWU-ZG2-2018的分歧時(shí)間約為2011年。使用不同符號(hào)標(biāo)出PTV在我國主要流行的幾個(gè)地區(qū)，可以看出大多數(shù)毒株的分歧時(shí)間都早于SWU-E5-2018、SWU-ZG2-2018，結(jié)果表明，PTV很有可能是由內(nèi)地豬群傳染給藏豬。BEAUti輸出模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、分支長度和核苷酸替換模型等參數(shù)進(jìn)行重復(fù)抽樣，得到穩(wěn)定的參數(shù)分布，輸出最大后驗(yàn)概率值的貝葉斯進(jìn)化樹，用FigTree軟件進(jìn)行展示(圖5)。估算出SWU-E5-2018 的分歧時(shí)間約為2010年，SWU-ZG2-2018的分歧時(shí)間約為2011年。使用不同符號(hào)標(biāo)出PTV在我國主要流行的幾個(gè)地區(qū)，可以看出大多數(shù)毒株的分歧時(shí)間都早于SWU-E5-2019、SWU-ZG2-2018，結(jié)果表明,PTV很有可能是由其他地區(qū)豬群傳染給藏豬。

3 討 論

目前，報(bào)道PTV至少有13個(gè)血清型，不同血清型毒株致病力不同，基因組也存在明顯差異，嚴(yán)重感染可造成豬群大量死亡，輕微者也可無明顯癥狀。1930—1950年，PTV毒株使歐洲養(yǎng)豬業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但隨后其毒力下降，高致病性的毒株被弱毒株所取代，雖然毒力不強(qiáng)，但此病毒的危害仍不容忽視[19]。藏豬是青藏高原特有的高原地方豬種，生活在青藏高原海拔2 500 ～ 4 300 m的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)，是瘦肉型小型豬，放牧飼養(yǎng)較為原始，對(duì)高海拔惡劣氣候有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，抗病力強(qiáng)，藏豬常年在田間放牧，牛羊混群飼養(yǎng)過程中相互接觸，在一定程度上為病毒的交叉感染提供了機(jī)會(huì)[20-21]，但關(guān)于PTV在藏豬中的感染及流行并不清楚。本研究通過對(duì)2017—2018年采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14個(gè)藏豬場共96份藏豬糞便樣本進(jìn)行PTV的檢測，流行病學(xué)初步調(diào)查結(jié)果表明，在糞便樣本中，PTV陽性率為20.8%(20/96，95%CI=13.2%～30.3%)；14個(gè)規(guī)模化藏豬場中，PTV檢出率為57.1%(8/14，95%CI=28.9%～82.3%)，說明PTV在藏豬中已存在且具有流行性。

本研究對(duì)20份PTV檢測陽性的樣本均進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增，最后只獲得了2條近似全基因組序列，長度分別為6 760和6 766 bp，全基因組擴(kuò)增成功率較低，僅為10%，可能是因?yàn)椴煌逍椭gVP1基因差異很大。運(yùn)用MegAlign進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明：2條PTV序列之間的全基因核苷酸相似性為83.1%，與GenBank上已登錄毒株之間的全基因核苷酸相似性為79.9%～91.3%。2條PTV序列之間ORF區(qū)的核苷酸相似性為82.8%，氨基酸序列相似性為86.3%；與GenBank上已登錄毒株之間ORF區(qū)核苷酸相似性為78.9%～91.2%，氨基酸序列相似性為82.8%～92.8%。2條 PTV序列之間的VP1基因核苷酸相似性為65.9%，氨基酸序列相似性為72.1%，說明不同血清型之間VP1基因差異很大，PTV的VP1基因平均進(jìn)化速率為每個(gè)位點(diǎn)每年2.46×103個(gè)替換[9]，高于目前研究中獲得的多聚蛋白基因，VP1氨基酸的變異是不同血清型PTV毒株毒力不同的主要原因[22]。國內(nèi)外41株P(guān)TV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明2條PTV序列的血清型分別為3型和6型。國內(nèi)主要報(bào)道的血清型為1型、2型、4型、8型、9型和10型[7-17]，對(duì)3型和6型毒株的報(bào)道較少，致病性有待進(jìn)一步研究。

通過RDP4和SimPlot軟件對(duì)2條PTV序列全基因組進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示SWU-E5-2018存在重組現(xiàn)象，重組位點(diǎn)位于衣殼蛋白P1區(qū)，本研究中SWU-E5-2018的重組來源于不同血清型之間。大多數(shù)關(guān)于PTV重組的報(bào)道都發(fā)生在不同血清型之間，Yang等[15]首次報(bào)道了PTV的重組也可來自同種血清型。表明PTV具有高度的遺傳多樣性。對(duì)于PTV的氨基酸替換，特別是對(duì)于結(jié)構(gòu)蛋白P1和ORF區(qū)的變異，可能影響PTV的復(fù)制、抗原表位和毒力，這些病毒蛋白質(zhì)變化的生物學(xué)意義還需要進(jìn)一步研究?！胺肿隅姟笔沁z傳學(xué)和分子生物學(xué)建立的一種模型，能夠通過分析遺傳數(shù)據(jù)解決大量流行病學(xué)問題[23-25]。本研究利用BEAST v1.8.0對(duì)71株P(guān)TV的全基因進(jìn)行了分歧時(shí)間的估算，估算出SWU-E5-2018的分歧時(shí)間約為2010年，SWU-ZG2-2018的分歧時(shí)間約為2011年，說明PTV可能是于2010年由其他地區(qū)豬群傳染給藏豬的。由于本研究是四川首次報(bào)道PTV，之前國內(nèi)也并沒有藏豬PTV相關(guān)報(bào)道，所以有關(guān)藏豬PTV在四川藏區(qū)的遺傳變異規(guī)律需進(jìn)一步研究。

豬是PTV的唯一宿主，病毒主要分布在豬的神經(jīng)組織中，成年豬在自然條件下感染PTV后，呈隱性感染狀態(tài)，可能不表現(xiàn)出任何臨床癥狀，但豬體可長期帶毒和排毒。PTV在其演化過程中極易發(fā)生重組，藏區(qū)放牧飼養(yǎng)在一定程度上為病毒的交叉感染提供了機(jī)會(huì)，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理以預(yù)防PTV在藏豬之間的交叉感染尤為重要。

4 結(jié) 論

對(duì)采集自四川省甘孜藏族自治州康定市的14個(gè)藏豬場共96份藏豬糞便樣本進(jìn)行PTV檢測，并對(duì)部分陽性樣品進(jìn)行全基因組的序列分析和基因分型，獲得了2條近似PTV全基因組序列；通過重組分析發(fā)現(xiàn)SWU-E5-2018存在重組現(xiàn)象；遺傳進(jìn)化研究表明，藏豬PTV很有可能是由其他地區(qū)感染豬群傳染給藏豬。