王怡夢,劉雪姣，王 倩,魏 慶，竇彩霞，尚智援，喬家運(yùn)，李海花*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

沙門菌(Salmonella)是一種寄生在人和動(dòng)物腸道中的人畜共患病原菌，血清型繁多且致病性強(qiáng)，可引起人類食物中毒，以及幼齡動(dòng)物胃腸炎、敗血癥等。6月齡以下斷奶仔豬較易感沙門菌，其中l(wèi)～4月齡多發(fā)，感染后可出現(xiàn)豬副傷寒等疾病。沙門菌作為一種主要的腸道致病菌，通常直接侵襲宿主的特殊抗原捕獲M細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞，破壞腸道的緊密連接[1]。緊密連接(tight junction TJ)是腸上皮細(xì)胞間的重要連接方式，緊密連接蛋白1(ZO-1)和閉合蛋白(Occludin)是其中兩種重要的緊密連接蛋白，影響腸道通透性，對于腸道黏膜的損傷修復(fù)十分關(guān)鍵。當(dāng)病原菌感染腸上皮細(xì)胞后，緊密連接蛋白的表達(dá)量下降，腸道通透性增加，病原菌突破上皮屏障并進(jìn)入腸道細(xì)胞后，引起仔豬腹瀉或腸道炎癥等疾病[2]。因此，研究ZO-1和Occludin在病原菌感染下的表達(dá)變化有助于了解病原菌對豬腸道屏障的影響。

核因子-κB(NF-κB)信號通路是機(jī)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的經(jīng)典通路，當(dāng)宿主細(xì)胞受到細(xì)菌感染后，細(xì)胞表面的模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式，將侵襲信號傳遞給免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)增加，刺激細(xì)胞因子的分泌，從而激活炎癥反應(yīng)[3]。革蘭陰性菌釋放的脂多糖(LPS)進(jìn)入機(jī)體，引起緊密連接蛋白異常表達(dá)，腸道屏障損傷后，內(nèi)毒素等穿過腸壁，誘導(dǎo)活化細(xì)胞表面Toll樣受體4(TLR4)激發(fā)下游的NF-κB信號通路，進(jìn)而促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子(IL-8和TNF-α等)的合成與釋放，繼而加重腸道的損傷[4]。Wnt/β-catenin信號通路是一條和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)且高度保守的信號通路，參與細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)等活動(dòng)[5]。當(dāng)細(xì)菌感染機(jī)體時(shí)，β-catenin能調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)和原癌基因(c-Myc)等靶基因的轉(zhuǎn)錄，cyclin D1和c-Myc是細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子，其上調(diào)能促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞的增殖，從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。用銅綠假單胞菌感染小鼠的巨噬細(xì)胞以及角膜上皮細(xì)胞后，激活了Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin蛋白表達(dá)量下降，引起細(xì)胞損傷[7]。但是，關(guān)于沙門菌引致細(xì)胞損傷與NF-κB/β-catenin信號通路之間的關(guān)系報(bào)道較少。

本試驗(yàn)以豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)為體外模型，研究了沙門菌對IPEC-J2的損傷作用，以及NF-κB/β-catenin信號通路在沙門菌引致細(xì)胞損傷中的作用，有助于深入了解沙門菌引致小腸上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和菌株

IPEC-J2細(xì)胞株購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；豬霍亂沙門菌自腸炎仔豬糞便中分離，由天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

RPMI Medium 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶EDTA消化液均購自美國Gibco公司，PBS緩沖液、青鏈霉素和DMSO均購自北京索萊寶生物公司。豬白細(xì)胞介素-8(IL-8)、豬腫瘤壞死因子(TNF-α)和豬乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒均購自美國BD公司。DNA和RNA核酸萃取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自美國GeneCpoeia公司。

1.3 沙門菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

將沙門菌接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，8 000 r·min-1離心5 min收集菌泥，然后，用滅菌生理鹽水洗滌菌沉淀3次，再加入適量的生理鹽水制成菌懸液。對菌懸液進(jìn)行倍比稀釋，采用懸滴法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落總數(shù)(cfu)計(jì)數(shù)，確定沙門菌菌液的濃度。

1.4 IPEC-J2的復(fù)蘇、傳代和培養(yǎng)

從液氮中取出凍存細(xì)胞，迅速置于37 ℃水浴中融化大約1 min，經(jīng)1 000 r·min-1離心1 min后棄去凍存液，再加入1 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將4 mL 含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM-1640細(xì)胞完全培養(yǎng)液倒入6 mm的培養(yǎng)皿，把細(xì)胞均勻接種到培養(yǎng)皿中，放入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%便可以傳代，將細(xì)胞培養(yǎng)上清倒掉，用不含血清的DMEM-1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗去死細(xì)胞等，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，晃動(dòng)平皿使其均勻浸沒培養(yǎng)皿整個(gè)底部，放入培養(yǎng)箱中消化1～2 min。然后用顯微鏡觀察，若細(xì)胞不貼壁且形態(tài)呈圓形，即可加入4 mL完全培養(yǎng)液終止其消化，然后用移液槍輕輕吹打細(xì)胞使其脫落下來。將消化好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用3 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后加入到含有適量培養(yǎng)液的100 mm培養(yǎng)皿中，靜置培養(yǎng)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中豬NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1和c-Myc基因的全序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。另外，ZO-1、Occludin和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的熒光定量PCR引物序列參考李?；ǖ萚8]的文獻(xiàn)報(bào)道。引物委托上海生工生物工程有限司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 熒光定量PCR

采用熒光定量PCR(qPCR)檢測ZO-1、Occludin、NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH的表達(dá)。方法參照李?；ǖ萚8]的文獻(xiàn)報(bào)道，簡述如下：用TacoTMRNA試劑盒中的裂解液收集并裂解待分析的細(xì)胞樣品，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明提取IPEC-J2細(xì)胞中總RNA，按照All-in-OneTMFirst cDNA Synthesis試劑盒說明書操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒操作說明進(jìn)行qPCR反應(yīng)體系的配制：上、下游引物各2 μL，all-in-one qPCR Mix (2×) 10 μL，cDNA 3 μL，補(bǔ)加DEPC處理的滅菌水至20 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，62 ℃或64 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件為72 ℃ 10 s、+0.3 ℃和95 ℃ 10 s。每個(gè)樣品均設(shè)置未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對照，同時(shí)，每個(gè)樣品均設(shè)置相應(yīng)的內(nèi)參作為對照，得到各自的熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用相對定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.7 沙門菌引起IPEC-J2損傷

將IPEC-J2細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%，使用沙門菌(1×103CFU·mL-1) 刺激IPEC-J2細(xì)胞3、6、12和24 h， 同時(shí)，設(shè)置未處理只加細(xì)胞培養(yǎng)液的對照組，每組3個(gè)重復(fù)。到達(dá)刺激時(shí)間后，用無菌管收集培養(yǎng)上清液，3 000 r·min-1離心20 min，仔細(xì)收集上清，用于分析LDH的含量。細(xì)胞的損傷程度通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量、貼壁細(xì)胞中LDH的含量以及漂浮培養(yǎng)液凋亡小體中LDH的含量而決定，細(xì)胞毒性(%)=培養(yǎng)上清液中LDH含量/總LDH含量×100，仔細(xì)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和凋亡小體以及貼壁細(xì)胞，再嚴(yán)格按照LDH的ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行LDH的檢測。上清液收集完畢后，用PBS清洗兩遍培養(yǎng)板中的細(xì)胞，每孔中加入200 μL的細(xì)胞裂解液，用于提取細(xì)胞中的RNA，采用上述qPCR方法分析ZO-1和Occludin的表達(dá)。

1.8 沙門菌感染IPEC-J2后對NF-κB/β-catenin信號通路的影響

將IPEC-J2細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)到80%，按照上述“1.7”中方法用沙門菌處理細(xì)胞，并在刺激細(xì)胞3、6、12和24 h后收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液。嚴(yán)格按照豬白細(xì)胞介素-8(IL-8)和豬腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒的說明書對細(xì)胞培養(yǎng)液中的促炎性細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。采用“1.6”的方法檢測細(xì)胞中NF-κBp65、β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達(dá)。

1.9 NF-κB信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

將IPEC-J2細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，使用10 μmol·L-1的NF-κB抑制劑BAY11-7082或二甲基亞砜(DMSO)處理細(xì)胞1 h，再用1 × 103CFU·mL-1的沙門菌刺激IPEC-J2細(xì)胞，刺激6、12和18 h后收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液。試驗(yàn)分組包括只加細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對照組、DMSO單獨(dú)處理組、抑制劑單獨(dú)處理組、DMSO處理細(xì)胞后用沙門菌刺激組、抑制劑處理細(xì)胞后用沙門菌刺激組，每組3個(gè)重復(fù)。按照上述ELISA方法檢測LDH、TNF-α和IL-8含量，以及qPCR方法檢測細(xì)胞中NF-κBp65，ZO-1和Occludin的表達(dá)。

1.10 β-catenin信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

根據(jù)豬β-catenin全基因序列，委托上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成特異性的siRNA。siRNA-β-catenin 序列：正向5′-GCAGCUGGAAUUCUUUCUATT-3′，反向5′-UAGAAAGAAUUCCAGCUGCTT-3′。陰性對照(siRNA-NC)序列：正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將IPEC-J2細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞，按照上述qPCR方法分析β-catenin的表達(dá)。同時(shí)，設(shè)置陰性對照轉(zhuǎn)染組。干擾效率分析表明，siRNA-β-catenin的干擾效率高達(dá)84.6%。

將IPEC-J2接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，用siRNA-β-catenin或siRNA-NC轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞6 h后，再用沙門菌刺激細(xì)胞，分別在細(xì)菌刺激后6、12和18 h收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液。試驗(yàn)分組包括只加細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對照組、siRNA-NC單獨(dú)轉(zhuǎn)染組、siRNA-β-catenin單獨(dú)轉(zhuǎn)染組、siRNA-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再用沙門菌刺激細(xì)胞組、siRNA-β-catenin轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再用沙門菌刺激細(xì)胞組，每組3個(gè)重復(fù)。按照ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中LDH含量，以及qPCR方法檢測細(xì)胞中β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達(dá)。

1.11 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA法進(jìn)行方差分析以及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示無顯著差異。另使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖像制作。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌引起IPEC-J2損傷

用沙門菌刺激IPEC-J2，分析沙門菌是否引起IPEC-J2損傷，結(jié)果見圖1。由圖1可知，試驗(yàn)組與對照組相比，ZO-1和OccludinmRNA表達(dá)量在6和24 h均極顯著下調(diào)(P<0.01)，并且在24 h表達(dá)量降低最多，表現(xiàn)為ZO-1和Occludin分別是對照組表達(dá)量的40%和45%；LDH的釋放量在6 h時(shí)極顯著高于對照組(P<0.01)，并且隨著沙門菌作用時(shí)間的延長，LDH的釋放量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。此試驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門菌抑制了IPEC-J2緊密連接蛋白的表達(dá)，影響了細(xì)胞的屏障功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same letter superscript means no significant difference (P>0.05). The same as below圖1 沙門菌引致IPEC-J2損傷Fig.1 Salmonella caused IPEC-J2 damage

2.2 沙門菌感染IPEC-J2后對NF-κB/β-catenin信號通路的影響

用沙門菌刺激IPEC-J2，分析沙門菌對NF-κB/β-catenin信號通路的影響，結(jié)果見圖2。由圖2A、2B和2C可知，與對照組相比，試驗(yàn)組TNF-α和IL-8的含量分別在感染后的3和6 h極顯著升高(P<0.01)，并且均隨著感染時(shí)間的延長而呈極顯著增加(P<0.01)；而試驗(yàn)組NF-κBp65的表達(dá)水平在感染后1 h極顯著高于對照組(P<0.01)，并且隨著感染時(shí)間的延長也呈極顯著增加(P<0.01)。由圖2D、2E和2F可知，與對照組相比，cyclinD1和c-Myc基因的表達(dá)量在3 h差異不顯著(P>0.05)，在6和12 h差異顯著(P<0.05)，在24 h呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)；β-catenin的表達(dá)水平在3、6和12 h差異不顯著(P>0.05)， 在24 h呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，沙門菌激活了NF-κB 信號通路，引發(fā)了細(xì)胞炎性反應(yīng)，此炎癥反應(yīng)強(qiáng)度可能超過了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)能力，使細(xì)胞出現(xiàn)了炎癥損傷；與此同時(shí)，沙門菌抑制了β-catenin信號通路，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)下降，減慢了細(xì)胞修復(fù)的速度，因而細(xì)胞損傷速度大于細(xì)胞修復(fù)速度，最終呈現(xiàn)出細(xì)胞損傷。

圖2 沙門菌對IPEC-J2中NF-κB/β-catenin信號通路的影響Fig.2 Effect of Salmonella on NF-κB/β-catenin signaling pathway in IPEC-J2

2.3 NF-κB信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

采用NF-κB抑制劑處理細(xì)胞，以確定NF-κB信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的作用，結(jié)果見圖3。由圖3可知，與空白對照組相比，DMSO處理組的NF-κBp65的表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)，而抑制劑處理組的NF-κBp65表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)；DMSO處理組和抑制劑處理組的ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)，DMSO+沙門菌處理組的NF-κBp65、TNF-α、IL-8和LDH的含量在各時(shí)間點(diǎn)均極顯著上升(P<0.01)，ZO-1和Occludin在各時(shí)間點(diǎn)卻均呈極顯著下降(P<0.01)；與DMSO+沙門菌處理組相比，抑制劑+沙門菌處理組的ZO-1的表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著升高(P<0.01)，Occludin表達(dá)水平在12和18 h也均呈極顯著增高(P<0.01)，同時(shí)，伴隨NF-κBp65、TNF-α和IL-8的表達(dá)以及LDH釋放量在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著降低(P<0.01)。此試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制NF-κB 信號通路可以減輕沙門菌引起的IPEC-J2損傷，NF-κB信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中發(fā)揮著一定的作用。

圖3 NF-κB信號通路參與沙門菌引起IPEC-J2損傷Fig.3 NF-κB signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage

2.4 β-catenin信號通路在沙門菌引起IPEC-J2損傷中的作用

采用小干擾RNA沉默IPEC-J2中β-catenin基因表達(dá)，以確定β-catenin信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的作用，結(jié)果見圖4。由圖4可知，與空白對照組相比，陰性對照組(siRNA-NC組)的β-catenin、cyclinD1和c-Myc表達(dá)量以及LDH的釋放量在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)，siRNA-β-catenin單獨(dú)處理組、siRNA-NC+沙門菌處理組和siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著降低(P<0.01)；與空白對照組相比，siRNA-β-catenin組、siRNA-NC+沙門菌處理組和siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的LDH釋放量在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著增加(P<0.01)；與siRNA-NC+沙門菌處理組相比，siRNA-β-catenin+沙門菌處理組的β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均呈極顯著降低(P<0.01)，LDH釋放量在6和12 h均呈極顯著增加(P<0.01)，在18 h呈增加趨勢但差異不顯著(P>0.05)。此試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制β-catenin信號通路可以加重沙門菌引起的IPEC-J2損傷，β-catenin信號通路在沙門菌引致IPEC-J2損傷中的發(fā)揮著一定作用。

圖4 β-catenin信號通路參與沙門菌引起IPEC-J2損傷Fig.4 β-catenin signaling pathway involved in Salmonella-induced IPEC-J2 damage

3 討 論

緊密連接是由跨膜和膜相關(guān)蛋白組成的多蛋白復(fù)合物，在腸道上皮屏障中發(fā)揮著重要作用，多種生理、病理因素參與改變緊密連接結(jié)構(gòu)的功能[9]。LDH是一種存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)的酶，一旦細(xì)胞被損傷破壞，LDH被釋放且含量升高。LDH常用來反映組織細(xì)胞的損傷以及損傷程度。本試驗(yàn)利用沙門菌感染IPEC-J2細(xì)胞，細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)量降低，培養(yǎng)上清液中LDH含量增加，表明緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞屏障功能受到破壞，IPEC-J2細(xì)胞受損。

NF-κB是一種多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控宿主細(xì)胞中細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[10]。Lei等[11]利用體外巨噬細(xì)胞和體內(nèi)小鼠模型，分析了鼠傷寒沙門菌毒力因子SrfA引起的炎癥反應(yīng)與NF-κB信號通路的關(guān)系，與野生型鼠傷寒沙門菌相比，SrfA缺陷型菌株能夠抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB的活化，降低小鼠炎癥反應(yīng)，提高小鼠存活率。這表明，鼠傷寒沙門菌引起的炎癥反應(yīng)與NF-κB信號通路的激活有一定的關(guān)系，并且這種炎性反應(yīng)與毒力因子SrfA有關(guān)系。本試驗(yàn)所用的沙門菌分離株來自腸炎仔豬糞便，經(jīng)生化試驗(yàn)和16S rRNA鑒定后，確定該菌株為豬霍亂沙門菌，并且該菌株對小鼠具有很強(qiáng)的致病性(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路被抑制后，豬霍亂沙門菌能夠降低IPEC-J2中NF-κBp65的mRNA表達(dá)，以及促炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α的表達(dá)和LDH的釋放，減輕了細(xì)胞損傷。這說明，本試驗(yàn)所用的豬霍亂沙門菌引起的炎癥反應(yīng)與NF-κB信號通路的活化有關(guān)，但是本試驗(yàn)所用豬霍亂沙門菌分離株是否具有毒力因子SrfA暫時(shí)還不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。除了發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門菌分離株對小鼠具有致死性外，本研究還發(fā)現(xiàn)，該菌株對IPEC-J2也具有很強(qiáng)的致死性。在本研究前期試驗(yàn)中，分別用濃度為1 × 102CFU·mL-1(低劑量)、1 × 103CFU·mL-1(中劑量)和1 × 104CFU·mL-1(高劑量)的豬霍亂沙門菌刺激IPEC-J2細(xì)胞，刺激細(xì)胞后6 h通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和檢測LDH的含量來分析該菌株對細(xì)胞的損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未刺激的對照組相比，3種劑量的沙門菌對細(xì)胞的毒性均顯著增強(qiáng)，其中高劑量沙門菌作用細(xì)胞6 h后，可見大量細(xì)胞不再貼壁而是呈圓形漂浮在培養(yǎng)液中，而中劑量和低劑量沙門菌作用細(xì)胞6 h后，細(xì)胞仍可貼壁生長并且無可見的形態(tài)變化。這說明，分離株作用劑量為1×104CFU·mL-1時(shí)能夠嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞，對IPEC-J2具有很強(qiáng)的致死性，故在本試驗(yàn)中，我們選擇1×103CFU·mL-1的作用劑量來研究沙門菌引致IPEC-J2細(xì)胞損傷。

在機(jī)體被細(xì)菌感染時(shí)，TLRs會通過不同機(jī)制激活相關(guān)的下游信號通路，NF-κB信號通路的激活和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞中TLR4的激活有關(guān)[12]。以感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)的仔豬為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分析嗜酸乳桿菌在NF-κB信號通路中的作用，試驗(yàn)結(jié)果為嗜酸乳桿菌通過抑制ETEC誘導(dǎo)的TLR4的表達(dá)來抑制NF-κB信號通路的激活，以此減輕ETEC引起的炎癥反應(yīng)[13]。在炎性腸病動(dòng)物中也觀察到NF-κB的表達(dá)增加，特別是在黏膜巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，同時(shí)伴有促炎細(xì)胞因子(如IL-8、TNF-α)的增加[14]。前人以IPEC-J2為研究對象，驗(yàn)證環(huán)境中廣泛分布的沙門菌菌株滲透和調(diào)節(jié)細(xì)胞先天免疫的能力，結(jié)果顯示，有3種沙門菌具有獨(dú)特的滲透IPEC-J2細(xì)胞的能力，且細(xì)胞因子IL-8、TNF-α的表達(dá)上調(diào)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，同時(shí)，此試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了，IPEC-J2細(xì)胞是評估宿主-腸道-病原菌相互作用的一個(gè)實(shí)用模型，并表明，IL-8和TNF-α可能是沙門菌侵襲腸道細(xì)胞的預(yù)測指標(biāo)[15]。

目前，與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)的研究較多，以沙門菌引起的結(jié)腸炎小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停治錾抽T菌對腸道干細(xì)胞的調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)，沙門菌激活了Wnt/β-catenin信號通路，沙門菌蛋白AvrA調(diào)節(jié)Wnt信號，β-catenin的表達(dá)上調(diào)，激活了Wnt/β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性[16]。本試驗(yàn)應(yīng)用沙門菌感染IPEC-J2細(xì)胞，β-catenin的表達(dá)量與其調(diào)控的靶基因cyclinD1和c-Myc均下降，表示β-catenin信號通路的下調(diào)參與沙門菌引起IPEC-J2細(xì)胞的損傷。這一結(jié)果雖與上述研究結(jié)果不一致，但有前人闡述，對于β-catenin發(fā)揮抗炎或促炎作用取決于刺激細(xì)胞的類型以及與其他信號通路的串?dāng)_[17]。Wnt/β-catenin信號通路可以通過抑制或激活NF-κB信號通路，參與炎癥反應(yīng)[18]。敲除小鼠樹突狀細(xì)胞中的β-catenin，用LPS感染細(xì)胞，結(jié)果顯示，激活了NF-κB信號通路和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)；此研究揭示了β-catenin的抗炎作用，表明Wnt/β-catenin信號通路或許通過不同的機(jī)制對NF-κB的活性產(chǎn)生抑制作用[19]。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體中普遍存在的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的重要信號通路之一，在生長發(fā)育等生理過程和腫瘤等病理過程中發(fā)揮著重要作用。RNA干擾技術(shù)作為一種強(qiáng)大的反基因技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于沉默相關(guān)基因的表達(dá)。應(yīng)用siRNA沉默β-catenin基因來阻斷Wnt/β-catenin信號通路，結(jié)果顯示，下調(diào)β-catenin的表達(dá)抑制了腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減輕了腎小管上皮細(xì)胞組織纖維化[20]。本試驗(yàn)應(yīng)用siRNA干擾IPEC-J2細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，再用沙門菌刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白cyclinD1和c-Myc的表達(dá)量下降，可能減緩了損傷細(xì)胞的修復(fù)，致使LDH釋放量增加，由此可見，豬霍亂沙門菌感染IPEC-J2后，β-catenin信號通路的下調(diào)加重了IPEC-J2細(xì)胞的損傷。本試驗(yàn)通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化證實(shí)，該信號通路在豬霍亂沙門菌致病性中發(fā)揮重要的作用。有相似研究利用痢疾志賀菌感染的大鼠回腸環(huán)模型，分析了β-catenin和NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中的作用發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀菌促進(jìn)β-catenin降解和NF-κB信號通路的活化，從而促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8的生成，引致大鼠回腸炎癥，此研究還表明，β-catenin是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白[21]。

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)用沙門菌感染IPEC-J2后，細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)量下降，細(xì)胞屏障功能受損，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增高；激活了NF-κB 信號通路，促進(jìn)了TNF-α和IL-8表達(dá)，細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成IPEC-J2損傷，NF-κB信號通路被抑制后，能夠降低NF-κB表達(dá)量，減輕細(xì)胞損傷；沙門菌抑制了Wnt/β-catenin信號通路，降低了β-catenin、cyclinD1和c-Myc表達(dá)，減緩了損傷細(xì)胞的修復(fù)，用siRNA沉默β-catenin的表達(dá)后，β-catenin 信號通路的下調(diào)進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。綜上所述，沙門菌通過激活NF-κB信號通路和抑制β-catenin 信號通路引致IPEC-J2損傷。