楊臘梅，張 婷，張 鼎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞異常增殖發(fā)生的腫瘤，多見(jiàn)于皮膚，但約有5%的黑色素瘤發(fā)生于實(shí)質(zhì)器官、眼膜和腹膜后間隙等部位[1]。細(xì)胞學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞形狀由正常圓形變?yōu)樗笮危殡S有明顯的核異常和細(xì)胞增生，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常含有棕色至黑色的黑色素顆粒[2]。黑色素瘤為各年齡段人群常發(fā)疾病，在動(dòng)物上也屢有報(bào)道。動(dòng)物黑色素瘤多發(fā)生于豬、犬、貓和兔等，但在家禽上的報(bào)道并不多見(jiàn)。Sry相關(guān)的HMg-Box基因10 (SOX10)和HMB-45抗體是兩種黑色素細(xì)胞特異性單克隆抗體，因其高特異性和準(zhǔn)確性被廣泛應(yīng)用于黑色素瘤的診斷[3-4]。本研究對(duì)臨床上發(fā)現(xiàn)的1例罕見(jiàn)肉雞肝惡性黑色素瘤病例進(jìn)行病理學(xué)診斷，旨在為禽類黑色素瘤的診斷和研究供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病雞檢查 病雞為AA肉雞，1日齡起與同齡雞集中飼養(yǎng)，自由采食。飼養(yǎng)過(guò)程中此雞精神沉郁、發(fā)育滯后，呈現(xiàn)消瘦狀態(tài)，25日齡時(shí)體重約為同齡肉雞的1/3。處死剖檢發(fā)現(xiàn)該雞肝整體呈黑色，除中度心包積液外，未見(jiàn)其他病理變化。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、肝膽色素染色液(G3290，改良Fouchet法)和普魯士藍(lán)染色試劑盒(G1424)均購(gòu)自北京索萊寶科技公司；HMB 45單克隆抗體(MAB-0098)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SOX 10單克隆抗體(ZA-0624)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘇木素-伊紅染色 將患病AA雞肝固定于10%多聚甲醛溶液中，切取適當(dāng)大小的肝組織小塊，用濃度梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋。制備厚度為4 μm的石蠟組織切片，蘇木素染色5 min，1%酸性乙醇染色10 s，后用0.5%的伊紅溶液染色3 min。 分別用濃度梯度乙醇和二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫水、透明，中性樹(shù)脂封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 試驗(yàn)分別用SOX 10和HMB-45單克隆抗體孵育肝切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。組織石蠟切片常規(guī)脫水、透明后用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，然后用3% H2O2溶液孕育30 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。切片用小鼠抗HMB-45單克隆抗體或兔抗SOX 10單克隆抗體孵育，4 ℃過(guò)夜。PBS清洗玻片，用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，DAB顯色和蘇木素復(fù)染后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 膽色素染色 試驗(yàn)采用Fouchet法對(duì)膽色素進(jìn)行染色。Fouchet染色液中試劑A由含三氯乙酸的溶液A1與含三氯化鐵的溶液A2以9∶1的比例混合而成。試劑B為VG染色液，由杜鵑花堿溶液和苦味酸溶液以1∶9的比例混合而成。用10%多聚甲醛溶液對(duì)肝切片進(jìn)行固定，浸入Fouchet染色液避光浸染10 min后流水沖洗，再放入VG染色液中浸染2 min，流水沖洗后用95%乙醇快速分化。將切片進(jìn)行無(wú)水乙醇脫水和二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 普魯士藍(lán)染色 采用普魯士藍(lán)染色試劑盒檢測(cè)含鐵血黃素在病變肝組織內(nèi)的沉積。制備厚度為4 μm的石蠟組織切片，常規(guī)脫水、透明后用Perls染色液染色30 min，蒸餾水清洗切片3次；肝細(xì)胞核用核固色液染色5 min。將切片進(jìn)行無(wú)水乙醇脫水和二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 病變肝蘇木素-伊紅染色觀察

病雞肝體積增大，整體呈黑色。肝切面粗糙，呈致密黑色，切面內(nèi)偶見(jiàn)塊狀結(jié)節(jié)、腫塊，觸之有顆粒感(圖1A)。HE染色結(jié)果顯示，病雞肝有大量黑色素瘤細(xì)胞分布，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。黑色素瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)多呈圓形、卵圓形和不規(guī)則型；細(xì)胞核大深染，核膜厚，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，核仁較為明顯；核分裂象多見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)豐富且可見(jiàn)黑色素顆粒(圖1B)。

A.分離的病變肝; B.蘇木精和伊紅染色肝組織(1 000×)A. The isolated liver; B. Hematoxylin and eosin staining of liver tissue (1 000×)圖1 病變肝及其蘇木精和伊紅染色Fig.1 Observation of the isolated liver and its pathological change(HE staining)

2.2 免疫組織化學(xué)染色

結(jié)果顯示，正常肝組織切片未著色，呈陰性結(jié)果(圖2A、2C)。病變肝與HMB-45單克隆抗體(圖2B)和SOX10單克隆抗體(圖2D)孵育后均呈明顯的陽(yáng)性反應(yīng)(褐色)，提示病變細(xì)胞為黑色素瘤細(xì)胞。黑色素瘤細(xì)胞部分為單細(xì)胞散在分布，部分呈現(xiàn)明顯的聚集性(圖2B、2D)。

A和C. 正常肝；B.HMB-45抗體孵育；D.SOX10抗體孵育A and C. Normal liver; B. HMB-45 antibody incubation; D. SOX10 antibody incubation圖2 病變肝免疫組織化學(xué)染色(1 000×)Fig.2 Immunohistochemical staining of the diseased liver(1 000×)

2.3 黑色素瘤鑒別診斷

膽色素沉積陽(yáng)性部位應(yīng)著綠色，本例病雞肝病變部位細(xì)胞染色呈灰褐色(圖3B)，提示本例病雞肝病變并非由膽汁淤積引起。普魯士藍(lán)染色后肝細(xì)胞核呈紅色，含鐵血黃素沉積的部位應(yīng)著藍(lán)色。本例病雞肝病變部位著色為深褐色(圖3D)，提示本例病雞肝病變部位并非鐵血黃素沉積。

A.正常肝膽色素染色；B.病變肝膽色素染色；C.正常肝普魯士藍(lán)染色；D.病變肝普魯士藍(lán)染色A. Bile pigment staining on normal liver; B. Bile pigment staining on diseased liver; C. Prussian blue staining on normal liver; D. Prussian blue staining on diseased liver圖3 肉雞肝黑色素瘤鑒別診斷(1 000×)Fig.3 Differential diagnosis of the liver melanoma in broiler chicken(1 000×)

3 討 論

研究表明，黑色素瘤可在多種禽類身上發(fā)生，如紅尾鷹(Buteojamaicensis)[2]、鴛鴦(Aixgalericulata)[5]、灰背隼(Falcocolumbarius)[6]、賽鴿(Columbalivia)[7]和洪堡企鵝(Humboldtpenguin)[8]等。禽類黑色素瘤多發(fā)于喙附近的皮膚、面部皮膚、腎上腺、卵巢和肺等，而發(fā)生于肝的黑色素瘤相對(duì)較少[2, 5-6, 8]。Kufuor-Mensah等[2]在1只鷹的喙部組織發(fā)現(xiàn)了黑色素瘤，黑色素細(xì)胞緊密排列，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黑色素顆粒豐富，而后在肌肉腎上腺和肝中發(fā)現(xiàn)類似黑色素細(xì)胞，疑似腫瘤轉(zhuǎn)移。Reid等[5]報(bào)道了1例患有黑色素瘤的成年雌性鴛鴦，堅(jiān)實(shí)的黑色多結(jié)節(jié)性腫塊由喙外部皮膚侵入并充滿鼻腔。2004年，有報(bào)道稱，1只雌性灰背隼死于黑色素瘤引發(fā)的呼吸困難，剖檢發(fā)現(xiàn)該灰背隼肝、脾和肺明顯增大，且分布有大量界限清楚的黑色球形結(jié)節(jié)[6]。Kajigaya等[7]發(fā)現(xiàn)1只賽鴿患有黑色素瘤，其黑色素細(xì)胞由下顎轉(zhuǎn)移至肝、腎和脾等器官。其中，肝病變最為明顯，體積增大且有大量黑色腫塊，肝竇內(nèi)可見(jiàn)大量黑色素細(xì)胞,黑色素細(xì)胞有大小不一的圓形或卵圓形泡狀核，核仁突出，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含大量黑色素顆粒。Feltrer Rambaud等[8]在剖檢1例患有惡性黑色素瘤的企鵝時(shí)發(fā)現(xiàn)，企鵝肝中有大量黑色斑塊，其直徑為2～3 mm至5～6 cm，HE染色結(jié)果顯示，這些黑色斑塊細(xì)胞中有大量的黑色素沉積，其特征與本試驗(yàn)觀察到的一致。Williams等[9]通過(guò)免疫組化和HE染色等方法成功鑒別了發(fā)生在仔雞身上的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)，由黑色素細(xì)胞異常增殖形成的多個(gè)腫瘤位于肝內(nèi)，染色顯示病變細(xì)胞大小不一，細(xì)胞質(zhì)中黑色素沉積明顯，并伴有中度核不對(duì)稱，這與本試驗(yàn)黑色素瘤分布和細(xì)胞特征相類似。

肝大面積發(fā)生黑色素瘤較為少見(jiàn)，因此，本研究用黑色素細(xì)胞相關(guān)抗體進(jìn)行免疫組化確認(rèn)。SOX10與黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且已被證明是黑色素瘤的敏感標(biāo)記物之一。SOX10能夠高度特異性地將黑色素瘤與其非黑色素細(xì)胞模擬物如切除疤痕、非典型纖維黃瘤和隆突性皮膚纖維肉瘤等區(qū)分開(kāi)來(lái)[10-12]。在超微結(jié)構(gòu)研究中， HMB-45作為一種單克隆抗體，能特異性的識(shí)別前黑色素小體球蛋白，可與不完全性黑色素瘤細(xì)胞及黑色素瘤特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，對(duì)惡黑瘤具有高度特異性和敏感性，反應(yīng)的陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈顆粒狀[13]。此抗體可用于冰凍新鮮組織及石蠟包埋組織，并適用于各種涂片細(xì)胞分析。在禽類腫瘤診斷過(guò)程中，已有使用HMB-45抗體診斷企鵝黑色素瘤的研究，而尚無(wú)SOX10抗體診斷禽類黑色素瘤的報(bào)道[14]。本試驗(yàn)的結(jié)果為禽類黑色素瘤的診斷提供參考依據(jù)，同時(shí)為SOX10和HMB-45抗體鑒別禽類黑色素瘤提供借鑒意義。

4 結(jié) 論

本研究利用HE染色、免疫組織化學(xué)和鑒別診斷方法，對(duì)1例肉雞肝惡性黑色素瘤進(jìn)行病理學(xué)診斷，結(jié)果為禽類黑色素瘤的診斷和深入研究提供了參考。