胡亞婕，劉 洋，姚睿智，史宏昭，劉 鵬，徐 彬，呂紅明，李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，動物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心；黑龍江省牛病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319)

寒冷是北方畜牧業(yè)常見應(yīng)激源之一，常誘導(dǎo)禽畜產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)。在寒冷條件下，動物機(jī)體主要通過增強(qiáng)自身代謝活動和骨骼肌收縮來增加產(chǎn)熱從而維持體溫恒定。因此，冷暴露中骨骼肌的功能及能量水平對維持機(jī)體運(yùn)動能力起著十分重要的作用。此外，骨骼肌除了作為運(yùn)動器官，還可以作為分泌器官分泌細(xì)胞因子，即肌細(xì)胞因子(myokines)[1]。其中，IL-6作為骨骼肌分泌的重要肌細(xì)胞因子之一，通過骨骼肌收縮產(chǎn)生、表達(dá)和釋放，參與機(jī)體能量代謝[2-3]。而蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾是細(xì)胞內(nèi)一種蛋白翻譯后修飾方式，O-GlcNAc糖基化修飾可以在機(jī)體應(yīng)激中充當(dāng)一種“應(yīng)激感受器”，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或基因表達(dá)[4-5]。因此，本試驗(yàn)使用小鼠成肌細(xì)胞系C2C12，檢測不同時(shí)長冷暴露下O-GlcNAc糖基化修飾及相關(guān)蛋白O-GlcNAc催化轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)、O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA)和IL-6表達(dá)變化。初步探討冷暴露下O-GlcNAc糖基化與IL-6表達(dá)之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成肌細(xì)胞系C2C12為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Clark Bioscience公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF(100 mmol·L-1)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、10×TBST購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯色液、PVDF膜(0.22 /0.45 μm)購自美國默克密理博公司。

抗體：Anti-O-linked-N-Acetylglucosamine(RL2，Abcam)，Anti-OGT/O-linked-N-Acetylglucosamine transferase(Abcam)，Anti-MGEA5/OGA antibody(Abcam)，Anti-IL-6 antibody(Abcam)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP，Abcam)，Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP，Abcam)，用于Western blot檢測。

1.2.2 主要儀器 SHP-250恒溫培養(yǎng)箱購自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；電泳槽、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國伯樂有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及冷暴露處理

復(fù)蘇C2C12細(xì)胞，細(xì)胞瓶中加入5 mL培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、1%雙抗)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞增長到匯合率為80%～90%，傳代，擴(kuò)增細(xì)胞。將C2C12細(xì)胞分為不做冷暴露處理的對照組(control組，37 ℃ ±0.5 ℃)、冷暴露(32 ℃±0.5 ℃，醫(yī)學(xué)臨床亞低溫溫度，已證實(shí)可引起體外培養(yǎng)細(xì)胞冷應(yīng)激反應(yīng))組，其中，冷暴露組又分為冷暴露3、6、9、12 h組。待細(xì)胞增長至80%匯合率時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理，具體試驗(yàn)方案如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)方案Fig.1 Experiment scheme

1.4 總蛋白提取及Western blot分析

C2C12細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)長冷暴露處理后，每瓶細(xì)胞加入PMSF終濃度為0.1 mmol·L-1的RIPA裂解液100 μL，然后使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞至1.5 mL離心管，并于冰上裂解30 min。13 000 r·min-1離心10 min， 取上清。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒按照說明書測定所提取細(xì)胞總蛋白濃度，并用RIPA裂解液進(jìn)行調(diào)整，使每組樣品蛋白濃度相同。將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按照4∶1的比例混合并煮沸，使蛋白變性。

按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制分離膠和濃縮膠。加入樣品，50 V恒壓電泳，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)改為120 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后，使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀250 mA將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，根據(jù)目的蛋白大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1.0～2.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜用1×TBST溶液配制5%脫脂乳室溫封閉1 h，用1×TBST溶液脫洗PVDF膜3次，每次10 min。按照抗體說明書用TBST稀釋抗體，孵育過夜。次日洗膜3次，每次10 min。二抗室溫下孵育1 h，然后洗膜3次，每次10 min。將ECL顯色液按照1∶1配制，使用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)長冷暴露下OGT和OGA表達(dá)變化

O-GlcNAc糖基化修飾受兩種拮抗酶即OGT和OGA調(diào)節(jié)從而維持動態(tài)平衡。不同時(shí)長冷暴露下C2C12 中OGT及OGA表達(dá)變化水平如圖2所示，不同時(shí)長冷暴露處理C2C12細(xì)胞后，OGT、OGA表達(dá)增加。與對照組比較，冷暴露3 h處理組OGT表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，冷暴露12 h組OGT表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)(圖2B)，而OGA表達(dá)水平在冷暴露處理6 h時(shí)顯著升高(P<0.05)(圖2C)。

A. Western blot結(jié)果；B. OGT表達(dá)變化；C. OGA表達(dá)變化。數(shù)據(jù)用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. OGT expression changes; C. OGA expression changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖2 不同時(shí)長冷暴露下C2C12細(xì)胞OGT及OGA蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression of OGT and OGA protein in C2C12 cells to different durations of cold exposure

2.2 不同時(shí)長冷暴露下O-GlcNAc糖基化修飾變化

不同時(shí)長冷暴露處理后，C2C12細(xì)胞O-GlcNAc糖基化修飾水平見圖3，與對照組比較，不同時(shí)長冷暴露處理后，O-GlcNAc糖基化修飾水平升高，冷暴露3 h，O-GlcNAc糖基化修飾水平極顯著升高(P<0.01)。

A. Western blot結(jié)果；B. 糖基化修飾水平。數(shù)據(jù)用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. Glycosylation changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖3 不同時(shí)長冷暴露下C2C12細(xì)胞O-GlcNAc糖基化修飾水平Fig.3 Expression of O-GlcNAc glycosylation in C2C12 cells to different durations of cold exposure

2.3 不同時(shí)長冷暴露下IL-6表達(dá)變化

C2C12細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)長冷暴露后，IL-6表達(dá)變化如圖4所示，與對照組相比，冷暴露處理3 h時(shí)，IL-6的表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)，冷暴露6 h，IL-6的表達(dá)水平較對照組顯著升高(P<0.05)，表達(dá)水平略低于冷暴露3 h，并且冷暴露9、12 h IL-6的表達(dá)水平持續(xù)升高。

A. Western blot結(jié)果；B. IL-6表達(dá)水平。數(shù)據(jù)用表示，*. P<0.05, **. P<0.01A. Western blot results; B. IL-6 expression changes. The data are expressed as *. P<0.05, **. P<0.01圖4 不同時(shí)長冷暴露下C2C12細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression of IL-6 protein in C2C12 cells to different durations cold exposure

3 討 論

O-GlcNAc糖基化修飾是一種高度動態(tài)且可逆的過程。OGT和OGA兩種酶催化細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯后的O-GlcNAc糖基化，對細(xì)胞內(nèi)、核和線粒體信號蛋白的數(shù)千個(gè)絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)殘基進(jìn)行修飾。OGT催化GlcNAc單糖從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移至底物Ser/Thr殘基上，而OGA作用正好與OGT作用相反[6-7]。在冷暴露處理3 h時(shí)，OGT表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，冷暴露處理6 h時(shí)，OGA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。OGT和OGA兩種調(diào)節(jié)酶共同調(diào)節(jié)O-GlcNAc糖基化修飾水平，并保持冷暴露3 h時(shí)O-GlcNAc糖基化高水平動態(tài)平衡。O-GlcNAc糖基化修飾作為“應(yīng)激感受器”，當(dāng)細(xì)胞感受到應(yīng)激時(shí)，整體的O-GlcNAc修飾水平會增加[8]。O-GlcNAc糖基修飾動態(tài)可逆地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝和信號通路，從而對各種應(yīng)激作出迅速的反應(yīng)[9]。Zachara等[10]用過氧化氫或亞砷酸鹽處理COS7細(xì)胞或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化水平升高。此外，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和熱應(yīng)激下O-GlcNAc糖基化水平升高[10-11]。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷暴露處理使C2C12細(xì)胞中蛋白O-GlcNAc修飾水平升高，在冷暴露處理3 h時(shí)，表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。O-GlcNAc 修飾水平在3 h時(shí)達(dá)到高峰，冷暴露6 h時(shí)O-GlcNAc糖基化修飾水平較3 h有所下降。但冷暴露6、9、12 h呈持續(xù)升高狀態(tài)。此外，Yao等[12]發(fā)現(xiàn)急性冷應(yīng)激下小鼠整體O-GlcNAc糖基化水平升高，筆者的結(jié)果與之相符。

IL-6是一種典型的細(xì)胞因子，是具有多種生物學(xué)活性的一種糖基化蛋白。有研究表明，暴露于急性應(yīng)激的人和嚙齒動物的外周IL-6水平升高[13-16]。并且Yildirim等[17]發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激可以誘導(dǎo)大鼠肝、肺、腦和心組織中IL-6表達(dá)增加。慢性間歇性冷應(yīng)激也會改變大鼠腦內(nèi)IL-6的表達(dá)[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷暴露處理C2C12細(xì)胞，與對照組相比，IL-6表達(dá)水平升高，在冷暴露處理3 h時(shí)，表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。 因此，與其他研究結(jié)果相同，筆者發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激引起C2C12細(xì)胞IL-6表達(dá)水平升高。Zhou等[14]研究發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激未造成大鼠組織損傷及炎癥，因此,IL-6在急性應(yīng)激條件下發(fā)揮非免疫學(xué)功能。此外，Wernsted等[19]發(fā)現(xiàn)在4 ℃時(shí)，與野生型小鼠相比，IL-6-/-的耗氧量和核心溫度都較低，冷誘導(dǎo)產(chǎn)熱較低。這表明內(nèi)源性IL-6對于小鼠在應(yīng)激和冷誘導(dǎo)的能量消耗中起重要作用。并且Febbraio等[20]研究結(jié)果顯示，骨骼肌在收縮時(shí)分泌的IL-6引起的內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生增加，維持骨骼肌內(nèi)糖原穩(wěn)定。Knudsen等[21]發(fā)現(xiàn)骨骼肌分泌IL-6可以調(diào)節(jié)葡萄糖攝取能力以及脂肪生成和脂肪分解，影響小鼠腹股溝白色脂肪組織質(zhì)量。這些研究都表明IL-6的表達(dá)影響機(jī)體能量代謝。

此外，不同時(shí)長冷暴露處理下O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達(dá)趨勢高度一致，均在冷暴露3 h時(shí)顯著升高，冷暴露6、9、12 h持續(xù)升高。有研究表明，T、B淋巴細(xì)胞中OGT介導(dǎo)的活化T細(xì)胞1(activated T cells 1，NFATc 1)和NF-κB的O-GlcNAc糖基化修飾是淋巴細(xì)胞激活所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[22]。NFATc 1和NF-κB的O-GlcNAc糖基化修飾可以促進(jìn)IL-6的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，NF-κB的RelA亞基的O-GlcNAc糖基化修飾后可以降低其與NF-κB抑制劑α(NF-κB inhibitor alpha，IκBα)的結(jié)合并增加其核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性[22-24]，進(jìn)而激活下游信號。因此，筆者推測冷暴露導(dǎo)致C2C12細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化修飾增加，激活NFATc 1以及NF-κB信號途徑，調(diào)控IL-6表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼肌中葡萄糖、脂質(zhì)代謝，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，最終保護(hù)機(jī)體免受冷暴露的損傷。

4 結(jié) 論

不同時(shí)長冷暴露下，C2C12細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達(dá)水平顯著升高，冷暴露3 h下達(dá)到高峰。并且O-GlcNAc糖基化修飾水平及IL-6表達(dá)趨勢高度相似，因此提示冷暴露下O-GlcNAc 糖基化修飾可能參與IL-6表達(dá)的調(diào)控，但O-GlcNAc糖基化修飾水平與IL-6表達(dá)之間的具體聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。