余永林 吳家順 熱合米丁·艾買提 周 倩 劉華慧 管曉舫

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院二橋院區(qū)，武漢 430051)

骨性關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)炎、老年性關(guān)節(jié)炎等，是因關(guān)節(jié)軟骨受到磨損或破壞引發(fā)的關(guān)節(jié)與關(guān)節(jié)周圍病變，其病理改變以軟骨退變?yōu)楹诵?，伴隨關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生與關(guān)節(jié)周圍軟組織炎癥反應(yīng)。臨床上主要通過(guò)非甾體類抗炎藥物緩解骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀，目前尚無(wú)直接治愈或能夠完全修復(fù)重建軟骨組織的藥物，因此軟骨損傷與退變后的修復(fù)重建一直是醫(yī)學(xué)研究的難題。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有良好的旁分泌能力與免疫調(diào)節(jié)活性，可直接分化形成特異性結(jié)締組織細(xì)胞并遷移至受損部位，刺激祖細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡與軟骨變性，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)，在骨性關(guān)節(jié)炎與軟骨損傷治療中具有重要意義[1-3]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cell,AMSC)與其他成體干細(xì)胞相比，具有來(lái)源豐富、增殖能力強(qiáng)、體積小、可傳代次數(shù)多、干細(xì)胞特性穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢(shì)，在骨性關(guān)節(jié)炎與軟骨損傷治療中受到廣泛關(guān)注，并取得了較好的效果[4-5]。

淫羊藿甙為淫羊藿的主要有效成分，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、壯筋骨等藥理活性，可促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成并激活成骨細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)MSC的成骨分化，促進(jìn)骨形成，同時(shí)還可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥與免疫等改善軟骨微環(huán)境，已成為治療骨性關(guān)節(jié)炎的常用中藥[6-7]。體外研究顯示，淫羊藿甙可促進(jìn)MSC增殖并誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化[8]。本實(shí)驗(yàn)主要觀察淫羊藿甙干預(yù)的AMSC治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的效果，并分析其可能的作用機(jī)制，以期為中藥聯(lián)合MSC移植治療骨性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性新西蘭大白兔，清潔級(jí)，體重2.3～2.5 kg，單籠飼養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由進(jìn)食水，正常光照。嚴(yán)格依照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中相關(guān)規(guī)定處理與飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.1.2實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的主要試劑 淫羊藿甙(489-32-7，純度：98%)為麻城市進(jìn)鑫生物科技有限公司產(chǎn)品；一氧化氮(NO)、IL-1、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒為上海仁捷生物科技有限公司產(chǎn)品；TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65一抗為艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的二抗為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基為武漢純度生物科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為南京生航生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1提取與鑒定AMSC 以3 ml/kg的劑量腹腔靜脈注射10%水合氯醛麻醉新西蘭大白兔3只，分離獲取其頸背部皮下的脂肪組織，去除血管等組織，PBS清洗3次后雙抗浸泡10 min，PBS清洗3次，將脂肪組織剪碎至乳糜狀后置于15 ml離心管，加入3倍體積的Ⅰ型膠原酶消化25 min，以含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化后過(guò)濾膠原酶消化液與脂肪顆粒，2 000 r/min 離心8 min，棄上清，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，8 h后首次換液，以后每3 d換液1次。約6 d時(shí)胰酶消化后第1次傳代，以后每第4～5 d傳代1次，直至得到第2代AMSCs。取第2代AMSCs懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，分裝于EP管中，分別加入單抗(CD90-FITC、CD105-FITC、CD44-FITC、CD14-FITC、CD45-FITC、CD19-FITC)標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AMSC免疫細(xì)胞表型。

1.2.2配制淫羊藿甙培養(yǎng)基 將2 mg淫羊藿甙溶解于2 ml DMSO，加入20 μl PBS，采用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，獲得1 mg/L的淫羊藿甙溶液，置于4℃環(huán)境中備用。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將淫羊藿甙溶液配制成20、40、60 g/L的濃度使用。

1.2.3淫羊藿甙對(duì)AMSC增殖的影響 ①提取第2代AMSCs，胰酶消化后接種于96孔板，150 μl/孔(約含細(xì)胞5×106個(gè))，觀察細(xì)胞貼壁后分5組處理，A組更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，B組更換為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，C組更換為20 g/L的淫羊藿甙培養(yǎng)基，D組更換為40 g/L的淫羊藿甙培養(yǎng)基，E組更換為60 g/L的淫羊藿甙培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔，培養(yǎng)48 h內(nèi)，每孔加入MTT液15 μl，檢測(cè)細(xì)胞增殖吸光度值。以此結(jié)果篩選細(xì)胞增殖良好的淫羊藿甙濃度；②提取第2代AMSCs，胰酶消化后接種于96孔板，150 μl/孔(約含細(xì)胞5×106個(gè))，觀察細(xì)胞貼壁后分3組處理，F(xiàn)組更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，G組更換為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，H組更換為60 g/L的淫羊藿甙培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔，培養(yǎng)3 d內(nèi)每天取1塊板進(jìn)行MTT檢測(cè)。以此篩選細(xì)胞增殖良好的處理時(shí)間。

1.2.4淫羊藿甙對(duì)AMSC軟骨分化的影響 取F、G、H組細(xì)胞，每隔1 d換液一次，培養(yǎng) 21 d 后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察軟骨基質(zhì)生成情況。

1.2.5建立骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型 采用10%水合氯醛麻醉30只新西蘭大白兔，將其仰臥位固定，在右后肢關(guān)節(jié)間隙切3 cm的縱行切口，打開關(guān)節(jié)腔后切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，打開關(guān)節(jié)囊后切斷前交叉韌帶并剔除內(nèi)側(cè)半月板，生理鹽水沖洗后消毒，逐層縫合后包扎傷口。術(shù)后肌注抗生素預(yù)防感染。術(shù)后6周制作右膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片證實(shí)造模成功。造模成功后2周將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分3組，實(shí)驗(yàn)組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射60 g/L淫羊藿甙溶液干預(yù)3 d的AMSCs懸液1 ml(約含細(xì)胞數(shù)1×107個(gè))，對(duì)照組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射AMSCs懸液1 ml(約含細(xì)胞數(shù)1×107個(gè))，空白組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水1 ml。

1.2.6關(guān)節(jié)液炎癥因子檢測(cè) 干細(xì)胞注射14 d后麻醉大鼠，向右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射1 ml生理鹽水，反復(fù)抽吸數(shù)次后抽取關(guān)節(jié)液，2 500 r/min離心12 min，將上清液置于-20℃環(huán)境中保存。ELISA法檢測(cè)上清液內(nèi)NO、IL-1與TNF-α濃度。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.7關(guān)節(jié)軟骨病理切片分析 關(guān)節(jié)液抽吸完成后處死所有大鼠，分離獲取膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本。將其置于100 g/L多聚甲醛中48 h，4℃脫鈣4周，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋與切片處理，切片厚度約4 μm，取部分切片進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，無(wú)水乙醇脫水后二甲苯透明，中性樹膠封固后鏡下觀察。

1.2.8軟骨損傷Mankin′s評(píng)分 由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的病理科醫(yī)師對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片進(jìn)行Mankin′s評(píng)分，最后計(jì)算平均分。該評(píng)分包括軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量與潮線的完整與否3個(gè)方面，評(píng)分0～14分，評(píng)分高說(shuō)明軟骨破壞嚴(yán)重。

1.2.9軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取部分膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本切片脫蠟，加入蛋白酶K工作液反應(yīng)20 min，PBS清洗3次后添加TUNEL反應(yīng)混合液反應(yīng)60 min，PBS清洗4次后添加DAB顯色液反應(yīng)5 min，蘇木精復(fù)染40 s，鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野記錄凋亡細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.10軟骨組織內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè) 取軟骨組織50 μg，加入適量裂解液檢測(cè)蛋白濃度，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，以含脫脂奶粉的封閉液浸泡PVDF膜2 h；將PVDF膜浸泡于稀釋的一抗[TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、TRAF6(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)、β-actin(1∶1 000)]孵育液內(nèi)24 h；清洗PVDF膜5次，將其浸泡于HRP標(biāo)記的二抗孵育液內(nèi)2 h；清洗PVDF膜5次，ECL顯色、曝光。

2 結(jié)果

2.1AMSC鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，AMSC高表達(dá)CD90、CD105、CD44，低表達(dá)CD14、CD45、CD19，表現(xiàn)出了較高的細(xì)胞純度，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AMSCs免疫表型

2.2淫羊藿甙對(duì)AMSC增殖的影響 培養(yǎng)48 h后，A、C組細(xì)胞增殖吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B、D、E組細(xì)胞增殖吸光度值高于A組(P<0.05)，B、E組細(xì)胞增殖吸光度值高于D組(P<0.05)，見(jiàn)圖2A，結(jié)果顯示60 g/L的淫羊藿甙培養(yǎng)基可明顯促進(jìn)AMSCs增殖。培養(yǎng)3 d內(nèi)，F(xiàn)、G、H組細(xì)胞增殖吸光度值均隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，培養(yǎng)1 d時(shí)3組間細(xì)胞增殖吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)2 d、3 d時(shí)的G、H組細(xì)胞增殖吸光度值高于F組，且G、H組細(xì)胞增殖吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B，結(jié)果顯示60 g/L淫羊藿甙培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d可明顯促進(jìn)AMSCs增殖。

圖2 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

2.3淫羊藿甙對(duì)AMSC軟骨分化的影響 F組未見(jiàn)特征性甲苯胺藍(lán)異染(圖3A)，G、H組胞漿可見(jiàn)特征性的甲苯胺藍(lán)異染(圖3B、C)。

圖3 AMSCs的甲苯胺藍(lán)染色(×100)

2.4關(guān)節(jié)液炎癥因子檢測(cè) 空白組關(guān)節(jié)液內(nèi)NO、IL-1與TNF-α濃度高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；對(duì)照組NO、IL-1與TNF-α濃度高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組炎癥因子濃度比較

2.5關(guān)節(jié)軟骨病理切片分析 空白組軟骨表面粗糙不平整，軟骨層較薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂，表層可見(jiàn)脫落的軟骨細(xì)胞，深層可見(jiàn)軟骨細(xì)胞減少或簇集排列，潮線模糊不清；對(duì)照組軟骨表面較光滑且平整，關(guān)節(jié)軟骨層次較完整，軟骨細(xì)胞排列較空白組規(guī)則，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，可見(jiàn)較清晰的潮線；實(shí)驗(yàn)組軟骨表面光滑平整，各層細(xì)胞排列規(guī)則有序，軟骨細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，可見(jiàn)清晰且完整的潮線，見(jiàn)圖4。

圖4 各組軟骨切片病理觀察(×100)

2.6軟骨損傷Mankin′s評(píng)分 空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組軟骨損傷Mankin′s 評(píng)分分別為9.24±1.27、6.17±1.47、4.36±0.78，空白組評(píng)分高于對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

2.7軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè) 空白組凋亡軟骨細(xì)胞最多，實(shí)驗(yàn)組凋亡的軟骨細(xì)胞最少，見(jiàn)圖5?？瞻捉M、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞凋亡率分別為(30.28±6.13)%、(19.23±2.09)%、(12.66±1.17)%，空白組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

圖5 各組軟骨細(xì)胞凋亡觀察(×200)

2.8軟骨組織內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè) 與空白組相比，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組軟骨組織內(nèi)的TLR4、MyD88、TRAF6與NF-κB p65蛋白表達(dá)量均減少(P<0.05)；且實(shí)驗(yàn)組TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 各組軟骨組織內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè)

3 討論

MSC在干細(xì)胞生物學(xué)研究、細(xì)胞與基因治療及組織工程研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是將其應(yīng)用于臨床還需要經(jīng)體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的MSCs。生長(zhǎng)因子可促進(jìn)MSCs增殖，但價(jià)格較高，且在臨床應(yīng)用中有諸多限制，因此近些年多數(shù)研究者開始利用中藥或中藥的有效成分促進(jìn)AMSCs增殖。淫羊藿甙作為淫羊藿的有效成分價(jià)格低廉，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖與軟骨基質(zhì)的分泌，抑制炎癥反應(yīng)，有效治療骨關(guān)節(jié)炎。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿甙在體外呈濃度與時(shí)間依賴性促進(jìn)MSCs增殖，驗(yàn)證了既往研究結(jié)論[9]。此外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，適當(dāng)濃度的淫羊藿甙在體外可促進(jìn)AMSCs分化為軟骨細(xì)胞。由此科研組認(rèn)為通過(guò)淫羊藿甙的誘導(dǎo)可調(diào)控AMSCs的增殖與向軟骨細(xì)胞的分化。但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的淫羊藿甙濃度與作用時(shí)間有限，對(duì)于最佳的干預(yù)濃度與干預(yù)時(shí)間還有待進(jìn)一步探討。

骨性關(guān)節(jié)炎的病理改變非常復(fù)雜，其主要骨病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的變性與炎癥因子的沉積等[10-11]。骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在大量促炎癥因子介導(dǎo)或促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞與關(guān)節(jié)周圍骨贅的形成，進(jìn)而促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎的形成或加重骨性關(guān)節(jié)炎，因此關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子水平可反映骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模后兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)的NO、IL-1與TNF-α濃度明顯升高，此3種炎癥因子在關(guān)節(jié)腔內(nèi)高水平聚集后作用于細(xì)胞，同時(shí)炎癥因子間又相互協(xié)同作用，激活相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，破壞關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與滑膜細(xì)胞的代謝，誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的降解、退變、老化及凋亡，加劇了關(guān)節(jié)炎癥。應(yīng)用淫羊藿甙溶液干預(yù)的AMSCs懸液治療后，可顯著降低骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎癥因子水平，進(jìn)而降低關(guān)節(jié)軟骨的降解、退變與軟骨細(xì)胞的凋亡，此結(jié)果在病理觀察中得到證實(shí)。并且這種關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用明顯優(yōu)于單獨(dú)AMSC的應(yīng)用。科研組認(rèn)為淫羊藿甙溶液干預(yù)的AMSC可抑制關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子水平，改善關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境，降低關(guān)節(jié)軟骨的降解并減少軟骨細(xì)胞的凋亡，具有關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用淫羊藿甙溶液干預(yù)的AMSCs懸液治療可顯著降低骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白表達(dá)。NF-κB p65是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中較常見(jiàn)的作用形式，與炎癥因子產(chǎn)生、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)密切相關(guān)[13-14]。TLR4是Ⅰ型跨膜蛋白受體之一，其可通過(guò)下游的MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)激活各種炎癥因子，研究證實(shí)其與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與發(fā)展密切相關(guān)[15]。TLR4與MyD88締合后將TRAF6募集到TLR4與MyD88的復(fù)合體，導(dǎo)致TRAF6的磷酸化，由磷酸化銜接子分子復(fù)合物將信號(hào)傳播到下游MAP激酶-AP1和IKK復(fù)合物NF-κB，刺激炎癥因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，淫羊藿甙干預(yù)可能通過(guò)降低TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65蛋白的表達(dá)來(lái)減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)的NO、IL-1與TNF-α濃度，從而抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低關(guān)節(jié)軟骨的降解并減少軟骨細(xì)胞的凋亡。由此課題組認(rèn)為淫羊藿甙發(fā)揮關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。但是在淫羊藿甙發(fā)揮關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用中是只通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路還是有其他通路參與目前還不能得出確切的結(jié)論，下一步將進(jìn)行TLR4/NF-κB信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

采用淫羊藿甙干預(yù)AMSCs可降低關(guān)節(jié)腔內(nèi)NO、IL-1與TNF-α等炎癥因子水平，改善骨性關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，且該作用可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為中藥聯(lián)合MSCs治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。