黃群蓮 胡運(yùn)春 陳永鈞 代良敏 代良萍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，瀘州 646000)

胰腺癌是一種診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。在全世界范圍內(nèi)，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率很高，中國(guó)胰腺癌的死亡率高達(dá)88%[1]。盡管近年來(lái)醫(yī)學(xué)治療上取得了非常大的進(jìn)展，但胰腺癌的死亡率并未得到明顯改善。一方面，其獨(dú)特的解剖位置使該疾病難以診斷；另一方面，大多數(shù)患者對(duì)化學(xué)療法產(chǎn)生抗藥性[2]。因此，胰腺癌患者需要更有效、毒性更小的治療方法。中藥化合物已成為胰腺癌患者體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的重要抗癌藥物和輔助藥物來(lái)源。淫羊藿苷是一種植物類黃酮苷，是中藥材淫羊藿中有效的藥理成分。淫羊藿苷因其雌激素樣作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、骨代謝、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)、性功能等具有廣泛的藥理作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。已有研究表明淫羊藿苷可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制卵巢癌、肺癌、食管癌等多種癌癥的發(fā)展，但其對(duì)胰腺癌的作用尚不清楚[4]。miRNA是一類長(zhǎng)度為20～24核苷酸的小型非編碼RNA，在細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞增殖以及分化等細(xì)胞中功能起關(guān)鍵作用。miR-9在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，發(fā)揮抑癌或致癌作用。已有研究表明，miR-9-5p在胰腺癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，這與胰腺癌患者生存時(shí)間較短有關(guān)[5]。因此，上調(diào)miR-9有望抑制胰腺癌的發(fā)展。本文利用體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞來(lái)研究淫羊藿苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制，為淫羊藿苷在臨床上治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 淫羊藿苷(HPLC≥98%，成都博瑞特化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號(hào)：110583)；順鉑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：PHR1624)；RPMI-1640培養(yǎng)基(上?；鄯f生物科技有限公司，貨號(hào)：C22400500BT)；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號(hào)：16000-044、15140122)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，貨號(hào)：111105-500)；BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號(hào)：BC201)；活化的胱天蛋白3(cleaved caspase-3)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、Ki67和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號(hào)：ab6728、ab15580、ab92552)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：11668-019)；miR-9 inhibitor質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；SYBR-Green PCR試劑盒(蘇州英弗基因科技有限公司，貨號(hào)：INFG801-01)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：BTN60906)。

1.1.2儀器 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；MuLTI SKAN GO 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自上海智理科學(xué)儀器有限公司；K8500全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自南京世研儀器。

1.1.3細(xì)胞及培養(yǎng) 胰腺癌BxPC-3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，于RPMI1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素)，在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 在96孔板中，將胰腺癌BxPC-3細(xì)胞分別用不同濃度淫羊藿苷(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)處理24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)，再用10 μl MTT染料處理細(xì)胞，然后與100 μl二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測(cè)量光密度。用各濃度處理組細(xì)胞吸光值與 0 μmol/L 組細(xì)胞的光密度表示細(xì)胞活性。

1.2.2分組及處理 將BxPC-3細(xì)胞分為對(duì)照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組、順鉑10 μmol/L組、miR-9 inhibitor組、淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組。對(duì)照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組BxPC-3細(xì)胞用終濃度含有Icariin 0、12.5、25、50 μmol/L 培養(yǎng)基培養(yǎng)；順鉑10 μmol/L組BxPC-3細(xì)胞用終濃度含有順鉑 10 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-9 inhibitor組和淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組利用Lipofectamine 2000將100 nmol/L的miR-9 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入胰腺癌BxPC-3細(xì)胞后，用終濃度含有淫羊藿苷0或50 μmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng) 將胰腺癌BxPC-3細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，其間每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定30 min，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25% 結(jié)晶紫染色20 min，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將胰腺癌BxPC-3細(xì)胞處理48 h后，胰酶消化胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min，按1×106個(gè)/ml的濃度重懸胰腺癌BxPC-3細(xì)胞。在胰腺癌BxPC-3細(xì)胞懸液中加入5 μl FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和5 μl碘化丙啶，暗環(huán)境孵化15 min，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率(%)+晚期細(xì)胞凋亡率(%)。

1.2.5蛋白印跡法檢測(cè)Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平 用RIPA裂解液提取各組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的總蛋白，并通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，并在室溫下，用脫脂牛奶封閉2 h。接著加入兔來(lái)源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000)，在4℃封閉過(guò)夜。然后加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)，室溫封閉1 h。最后滴電化學(xué)發(fā)光液曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6RT-qPCR檢測(cè)miR-9 mRNA的表達(dá) 通過(guò)QIAzol裂解試劑提取1.2.2中各組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的總RNA，再通過(guò)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行miR-9 mRNA測(cè)定。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化。miR-9的上游引物序列：5′-GAGACATAGGTATCTTGTCCC-3′，miR-9的下游引物序列：5′-GCTTAGGACTAGGGACTCAACC-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖 如圖1所示：各不同濃度組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞吸光值隨時(shí)間變化逐漸出現(xiàn)差異，在24 h時(shí)，與0 μmol/L 組相比，50和100 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞吸光值明顯減少(P<0.05)；在48 h時(shí)，與0 μmol/L組相比，25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞吸光值明顯減少(P<0.05，P<0.01)；在72 h時(shí)，與0 μmol/L組相比，12.5、25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞吸光值明顯減少(P<0.05，P<0.01)。選擇淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT法檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷處理不同時(shí)間對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目及增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki67表達(dá)無(wú)明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)、增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki67表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L 組克隆胰腺癌BxPC-3細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)，增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki67表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖2 不同濃度淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的影響

2.2淫羊藿苷誘導(dǎo)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡 如圖3所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達(dá)均無(wú)明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)增加(P<0.05)、凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)顯著增加(P<0.01)、凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖3 不同濃度淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡的影響

2.3淫羊藿苷上調(diào)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9的表達(dá) 如圖4A所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 和順鉑 10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)無(wú)明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，淫羊藿苷50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。如圖4B所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。

圖4 RT-qPCR檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷對(duì)miR-9 mRNA表達(dá)影響

2.4淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用與miR-9上調(diào)有關(guān) 如圖5所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組克隆胰腺癌BxPC-3細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)、增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki67表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)、增殖標(biāo)記相關(guān)蛋白PCNA和Ki67表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)、增殖標(biāo)記相關(guān)蛋白PCNA和Ki67表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖5 淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用與miR-9上調(diào)有關(guān)

2.5淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用與miR-9上調(diào)有關(guān) 如圖6所示：與對(duì)照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)顯著增加(P<0.01)、凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)顯著減少(P<0.01)、凋亡標(biāo)記蛋白Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著增加(P<0.01)、凋亡標(biāo)記相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖6 淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用

3 討論

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，由于其表現(xiàn)較晚，癥狀不明確，缺乏有效的篩查手段，確診時(shí)已經(jīng)為晚期[6]。手術(shù)切除是胰腺癌的常用療法，但是，只有大約20%的胰腺癌可以手術(shù)切除，其余的胰腺癌患者不得不依靠放射線和化學(xué)療法，但是這些療法產(chǎn)生的治療效果小，存活率低[7]。胰腺癌預(yù)后很差，總體5年生存率只有5%～6%[8]。因此，急需開(kāi)發(fā)治療胰腺癌的新藥物。淫羊藿苷是一種從中藥材淫羊藿中提取的植物類黃酮苷，具有調(diào)節(jié)免疫、抗抑郁、改善心血管功能等多種藥理活性。且已有眾多研究表明，淫羊藿苷具有廣泛的抗癌活性，可以有效地靶向癌癥干細(xì)胞和耐藥癌細(xì)胞，其作用機(jī)制包括細(xì)胞增殖凋亡及周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞侵襲遷移的調(diào)節(jié)、抗血管生成、抗轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)等[9]。如，淫羊藿苷通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)，對(duì)人食管癌細(xì)胞具有抗癌作用[10]；淫羊藿苷通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR/ATG5途徑抑制自噬，增強(qiáng)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷呈劑量依賴性抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞具有增殖速度快并無(wú)限復(fù)制的特性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力可有效抑制腫瘤的發(fā)展。已有報(bào)道，淫羊藿苷可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖[12]。PCNA和Ki67是目前運(yùn)用最為廣泛的增殖標(biāo)記蛋白，其表達(dá)量和細(xì)胞的增殖能力成正比[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷減少胰腺癌BxPC-3細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目，下調(diào)增殖標(biāo)記蛋白PCNA和Ki67表達(dá)。因此，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖。在正常機(jī)體中，細(xì)胞增殖與凋亡是處于動(dòng)態(tài)平衡的，而在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞增殖與凋亡是失衡的[14]。凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的形式，具有復(fù)雜多樣的潛在機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到物理刺激、藥物或放射線刺激時(shí)，它們會(huì)通過(guò)受體將這些信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中。惡性腫瘤通常表現(xiàn)出凋亡失調(diào)現(xiàn)象。已有研究表明，淫羊藿苷通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制卵巢癌SKVCR細(xì)胞自噬，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本研究表明，淫羊藿苷增加胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)記蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)，下調(diào)凋亡標(biāo)記蛋白Bcl-2表達(dá)。Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者[16]。Bcl-2可抑制細(xì)胞色素C的釋放及caspase-3的激活，并可拮抗促凋亡基因Bax，抑制細(xì)胞的凋亡[17-18]。因此，淫羊藿苷誘導(dǎo)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡。

眾所周知，miRNA在細(xì)胞遺傳學(xué)中起著重要的作用。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近的研究報(bào)道，淫羊藿苷通過(guò)下調(diào)甲狀腺癌細(xì)胞中miR-625-3p來(lái)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。已有研究報(bào)道，miR-9-5p在胰腺癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-9-5p可以顯著抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖和侵襲[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷上調(diào)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9的表達(dá)，抑制miR-9表達(dá)可逆轉(zhuǎn)淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖和凋亡的作用。而陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞miR-9的表達(dá)并無(wú)影響。這說(shuō)明雖然陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑與淫羊藿苷對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖和凋亡具有類似的作用效果，但是其作用機(jī)制卻有所不同。淫羊藿苷可通過(guò)上調(diào)miR-9抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡。

綜上所述，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡，這與miR-9上調(diào)有關(guān)。本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的初步探討，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和更為詳細(xì)的相關(guān)分子通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。