劉 霄 楊 姝 陳 敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腹部腫瘤科，遵義 563000)

結(jié)腸癌是發(fā)病率排名前三的胃腸道惡性腫瘤，易發(fā)病于40～50歲人群，近年來(lái)其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[1]。目前，結(jié)腸癌的治療以減少?gòu)?fù)發(fā)率和提高生存率為主要目標(biāo)，主要手段包括手術(shù)、化療和放療等綜合治療；近年研究表明，非甾體類(lèi)抗炎藥可預(yù)防消化道腫瘤的產(chǎn)生，與抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)[1-2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)能活化AKT，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號(hào)傳導(dǎo)。尼莫地平(Nimodipine，Nim，C21H26N207)是第二代1,4-二氫吡啶鈣通道阻滯劑，能通過(guò)阻斷非活性構(gòu)象的L型鈣通道避免鈣離子大量涌入，從而防治血管收縮，具有親脂性，能穿越血腦屏障，因此主要應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血管痙攣的治療[3]。此外，研究表明，Nim還具有神經(jīng)保護(hù)作用，在許多耳鼻咽病的治療中發(fā)揮作用[4]。有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與腦血管病變相關(guān)的認(rèn)知功能下降有關(guān)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(2VO)模型大鼠經(jīng)Nim治療4周后，PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白明顯上調(diào)，腦損傷也顯著減輕[5]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)控癌癥治療的新途徑，該通路參與了前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、增殖、遷移和侵襲，而Ras抑制劑能通過(guò)該通路過(guò)抑制SW480細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6-7]。但Nim能否通過(guò)PI3K/AKT通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞為研究對(duì)象，研究Nim對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)自北京中科院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；DMSO購(gòu)自上海生工；Nim(純度≥98%)、RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Nim用DMSO和無(wú)血清培養(yǎng)基溶解配制；Transwell小室購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司；Matrix基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物科技公司；單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.1.3主要儀器 3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司；TDL-5-A離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠；FACS AriaⅡ 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；CW-CJ-2F超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州云星儀器有限公司；普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)可傳代。

1.2.2CCK8實(shí)驗(yàn) 將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞以2×104個(gè)/ml接種于96孔板，每孔加入100 μl，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為4組：Control(對(duì)照)組、Nim 10、20和50 μmol/L組，分別給予對(duì)應(yīng)終濃度Nim，每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；再設(shè)置4個(gè)亞組，分別在上述操作后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h，之后每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)孵育4 h。450 nm吸光度于酶標(biāo)儀測(cè)定各組人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù) 以1×105個(gè)/ml將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)用胰酶收集細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml。嚴(yán)格按照FITC-Annexin V試劑盒說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣本加入5 μl的FITC-Annexin V和PI染色液，室溫避光孵育15 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn) 以1×105個(gè)/ml將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)，加入1.2.2所述濃度藥物處理24 h。胰酶收集細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml，接種于提前用Matrigel基質(zhì)膠包被好的Transwell小室上層，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液，小室下層加入含胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌拭去Matrigel基質(zhì)膠和小室上層細(xì)胞，PBS洗滌3次，4 %多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色細(xì)胞，流水沖洗后自然晾干。鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 用記號(hào)筆在12孔板背面畫(huà)出5條平行直線，滅菌備用。以1×105個(gè)/ml將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種于滅菌的12孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基和5 μg/ml絲裂霉素C培養(yǎng)12 h以抑制細(xì)胞增殖[8]。再用10 μl槍頭垂直于記號(hào)筆橫線劃痕，PBS清洗3次。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別為Control(對(duì)照)組、Nim 10、20和50 μmol/L組，給予對(duì)應(yīng)終濃度藥液處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并拍照。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 用RIPA蛋白裂解液于冰上裂解提取各組細(xì)胞總蛋白，4℃離心后取上清用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。棄一抗，清洗后加入對(duì)應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.7740Y-P對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響 加入PI3K激活劑740Y-P，將SW480細(xì)胞隨機(jī)分為4組：Control組、Nim50 μmol/L組、740Y-P組和740Y-P+Nim 50 μmol/L組。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，Western blot 檢測(cè)Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞增殖的影響 CCK8法檢測(cè)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理后SW480細(xì)胞增殖均明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.04，P<0.001，圖1)，且SW480細(xì)胞增殖與Nim處理濃度呈負(fù)相關(guān)。提示Nim對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖活性的抑制作用具有劑量依賴(lài)性。

圖1 CCK8法檢測(cè)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖

2.2Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著Nim給藥濃度增大，10、20和50 μmol/L Nim處理組SW480細(xì)胞凋亡率增加(F=85.82，P<0.001，圖2)。提示Nim能劑量依賴(lài)性地增加體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞的凋亡率。

圖2 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.3Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell檢測(cè)SW480細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)Nim處理后各給藥組鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少(F=85.09，P<0.001，圖3)，且Nim濃度越大，侵襲細(xì)胞數(shù)越少。提示Nim能劑量依賴(lài)性地降低SW480細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(×400)

2.4Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nim對(duì)SW480細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)Nim處理24 h后各劑量組劃痕愈合率隨Nim濃度增大而明顯降低(F=44.00，P<0.001，圖4)。提示Nim能有效抑制體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，且抑制作用與處理濃度呈正相關(guān)。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力(×200)

2.5Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，Nim 10、20和50 μmol/L組細(xì)胞Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平均被抑制，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值分別為82.54、78.55和72.94，P均<0.001，且這種抑制作用與Nim濃度呈正比；與對(duì)照組相比，各劑量組cl-caspase-3的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與Nim濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.19,P<0.001)。以上結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞中，Nim能劑量依賴(lài)性地促進(jìn)cl-caspase-3表達(dá)，抑制Ki67、MMP-2和MMP-9表達(dá)，從而抑制SW480的體外生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)。

圖5 SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6Nim對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞信號(hào)通路的影響Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，各Nim處理組細(xì)胞p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平被明顯抑制，F(xiàn)值分別為61.04和42.92，P均<0.001，且這種抑制作用與Nim濃度呈正比。提示Nim能劑量依賴(lài)性地抑制p-PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達(dá)，從而影響PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖6 Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.7Nim、740Y-P單用/聯(lián)用對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響 用50 μmol/L Nim和PI3K激活劑740Y-P單獨(dú)或共處理SW480細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用Nim或740Y-P可分別顯著降低或增加SW480細(xì)胞的增殖(F=10.25，P=0.008)，而兩者共處理時(shí)，SW480細(xì)胞的增殖較740Y-P單用時(shí)也顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖7A；如圖7B，單獨(dú)使用50 μmol/L Nim或740Y-P處理較對(duì)照組可顯著增加或降低SW480細(xì)胞的凋亡率(F=23.36，P=0.005)，而與單用740Y-P相比，兩者聯(lián)合使用可增加細(xì)胞凋亡率(F=35.10，P=0.007)；與對(duì)照組相比，單用50 μmol/L Nim或740Y-P能顯著抑制或增加侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率(F=31.69，P<0.001)，而兩者聯(lián)用較單用740Y-P可顯著降低侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率(F=56.22，P<0.001，圖7C、D)；與對(duì)照組相比，單用Nim處理SW480細(xì)胞能抑制Ki67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達(dá)，促進(jìn)cl-caspase-3蛋白表達(dá)(F=15.02，P=0.001)，單用740Y-P作用則剛好相反(F=8.69，P=0.006，如圖7E)，但與之相比，兩者聯(lián)用可有效逆轉(zhuǎn)單用740Y-P對(duì)上述蛋白表達(dá)的影響(F=27.36，P<0.001)。

圖7 Nim與740Y-P共處理對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力影響

以上結(jié)果表明，Nim能有效逆轉(zhuǎn)PI3K激活劑740Y-P對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且越來(lái)越年輕化。癌癥的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，主要表現(xiàn)為對(duì)抗生長(zhǎng)抑制信號(hào)、無(wú)限增殖、凋亡抵抗、異常代謝(如Warburg效應(yīng))等[9]。PI3K/AKT通路的異常激活常與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、癌癥發(fā)展及藥物耐藥性有關(guān)，因此臨床上有許多靶向該通路的藥物單獨(dú)或聯(lián)用于實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的治療，如激活PI3K/AKT通路能誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Nim通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白能有效改善2VO模型大鼠的腦損傷和學(xué)習(xí)記憶能力[5]。因此，本文針對(duì)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞研究Nim能否通過(guò)PI3K/AKT通路對(duì)SW480細(xì)胞產(chǎn)生影響。

細(xì)胞異常增殖和凋亡抑制是腫瘤發(fā)生的重要特點(diǎn)，因此抑制其增殖和促進(jìn)其凋亡發(fā)生是抗癌藥開(kāi)發(fā)的重要思路。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，益智油(高良姜石油醚餾分)通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)、下調(diào)PI3K表達(dá)、抑制AKT磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而對(duì)肝癌HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制[12]。EG-VEGF是一種來(lái)自?xún)?nèi)分泌腺體的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，研究發(fā)現(xiàn)，EG-VEGF沉默能通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制胰腺癌PC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[13]。另有研究認(rèn)為，LINC01133作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在多種腫瘤中高表達(dá)，敲除LINC01133后能對(duì)肝癌HCC細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用[14]。本文研究發(fā)現(xiàn)，Nim處理SW480細(xì)胞后，能下調(diào)增殖相關(guān)蛋白Ki67表達(dá)，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白cl-caspase-3表達(dá)，從而抑制SW480細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是抗癌藥的又一重要靶點(diǎn)。MMPs是一類(lèi)蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；MMP-2和MMP-9的高表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[15]。研究表明，決明子蒽酮-C-糖苷、決明子苷在結(jié)腸癌荷瘤小鼠體內(nèi)起抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用，其主要機(jī)制與抑制VEGF和MMP-9表達(dá)及VEGFR-2磷酸化等有關(guān)[16]。五味子乙素則能抑制p-AKT、p-mTOR和MMP-9表達(dá)，從而劑量依賴(lài)性地抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。Ras抑制劑通過(guò)抑制Ras-PI3K-AKT-HIF-1α途徑下調(diào)賴(lài)氨酰氧化酶而顯示出對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的抗轉(zhuǎn)移作用[7]。RNA螺旋酶DHX33是調(diào)節(jié)一系列參與細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因，其敲除可導(dǎo)致體內(nèi)和體外膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移，其產(chǎn)生可被PI3K和mTOR抑制劑誘導(dǎo)[18]。本研究也表明，Nim能有效下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白在SW480細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。

PI3K隸屬于磷脂激酶家族，機(jī)體內(nèi)多種生長(zhǎng)因子均能激活PI3K而產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)而結(jié)合活化含有PH結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸激酶AKT，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號(hào)傳導(dǎo)。大量研究表明，包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展都可能與該通路的異常激活相關(guān)，如卵巢癌，宮頸癌，肝癌[12,19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性阻塞性肺病(COPD)中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)高表達(dá)通過(guò)激活EGFR/PI3K/AKT通路上調(diào)炎癥因子表達(dá)水平加重COPD的病理改變[22]。研究表明，沉默促凋亡p53蛋白2(apoptosis-stimulating p53 protein 2,ASPP2)后，能通過(guò)PI3K/AKT通路影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[23]。另有研究證明，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，長(zhǎng)非編碼RNA PlncRNA-1可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的進(jìn)展，而PlncRNA-1基因敲除可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，同時(shí)促進(jìn)其凋亡[24]?？鄥A(oxymatrine,OMT)和/或奧沙利鉑(OXA)處理結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和SW480結(jié)果表明二者均具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用，且具有協(xié)同作用。另外，二者聯(lián)用還能通過(guò)降低PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。本研究也證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路是Nim抑制SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的作用機(jī)制。

本研究認(rèn)為，Nim能抑制體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡，影響凋亡相關(guān)分子cl-caspase-3、增殖相關(guān)蛋白Ki67、MMP-2、MMP-9及信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT/AKT的表達(dá)水平；還能在單用或與PI3K激活劑740Y-P聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的抑制作用。綜上所述，Nim能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的抑制作用。因此，Nim可能是一種潛在的治療結(jié)腸癌的藥物。