何江樞，陳 林，劉 迅，董陶濤，何平林,羅 旭,陳書練，楊 進

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000；2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610081)

間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis，IC)，也稱膀胱疼痛綜合征(bladder pain syndrome，BPS)是一種以持續(xù)性疼痛為特征的綜合征，與膀胱有關(guān)，伴有尿頻或尿急，臨床表現(xiàn)多種多樣[1]?；谌丝谘芯勘砻?女性與男性的比例大約為5∶1，甚至較高，并且通常伴發(fā)睡眠功能障礙、焦慮、抑郁和性功能障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。根據(jù)一些研究報道，IC與自身免疫、感染、上皮損傷、毒素和肥大細胞浸潤等因素存在一定關(guān)聯(lián)[3]。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CYP)作為IC造模中最常使用的一種藥物，CYP模型概括許多IC/BPS的典型特征，不僅造成的炎癥效果較好，而且在穩(wěn)定性上具備明顯優(yōu)勢，得到國內(nèi)外的廣泛認可[4]。但CYP通常用作腹腔注射，并未直接接觸到膀胱黏膜，因此造成的炎癥效果可能不是最佳的。而IC造模的實驗動物與以往比較幾乎無變化，犬用作IC造模的報道少之又少。因此本研究在CYP模型基礎(chǔ)上加以創(chuàng)新，利用兒童硅膠導(dǎo)尿管(F12)向犬膀胱內(nèi)灌注CYP溶液來建立IC模型，同時模擬膀胱穿刺診斷人類IC的過程，這可能為研究和診斷IC提供一個全新的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性比格犬6只(6～8個月，10～15 kg),購自成都達碩實驗動物有限公司。所有比格犬均在同一認證設(shè)施下飼養(yǎng)，環(huán)境、濕度和溫度都有控制，光∶暗周期為12∶12 h。在標(biāo)準(zhǔn)的實驗室條件下，每個籠子1只，自主獲得食物和水。所有的實驗程序和實驗設(shè)計都是按照美國國立衛(wèi)生研究院的《實驗動物護理和使用指南》進行的。成都大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)所有動物實驗(許可證號：LL/KY-201502-03)。為盡可能減少動物的痛苦，所有手術(shù)都是在肌肉注射戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉下進行的。

1.2 實驗設(shè)計將6只雄性比格犬按完全隨機設(shè)計法分成對照組(n=3)、實驗組(n=3)，肌肉注射戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉后，對照組通過兒童硅膠導(dǎo)尿管(F12)向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水30 mL，實驗組通過兒童硅膠導(dǎo)尿管(F12)向膀胱內(nèi)灌注CYP(0.2 g)溶液30 mL，每周灌注1次，維持3周。在第4周使用一次性活檢穿刺針在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部皮膚逐層穿刺至膀胱全層，并用40 g/L多聚甲醛溶液固定膀胱穿刺組織，觀察實驗組與對照組膀胱組織染色及肥大細胞浸潤情況。此外，當(dāng)出現(xiàn)嚴重血尿、尿量減少等癥狀時，我們根據(jù)這些癥狀重新分級，以確定膀胱過度損傷的惡化程度及是否進行人道終止。在所有實驗結(jié)束后，我們用戊巴比妥鈉對犬實施安樂死。

1.3 導(dǎo)尿及膀胱灌注的方法因造模試劑CYP必須進入膀胱方能起預(yù)期作用，故膀胱灌注操作是本實驗所必須的操作。將犬用戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉后，腹部向上置于實驗臺，固定四肢，嘴用特制嘴套固定。將恥骨前方皮毛備皮，暴露尿道口，用碘伏棉球擦拭尿道口及周圍皮膚[5]。取兒童硅膠導(dǎo)尿管(F12)作為犬導(dǎo)尿管。導(dǎo)尿管前段用石蠟潤滑后沿尿道口緩緩插入，當(dāng)見有尿液流出說明已進入膀胱。連接注射器抽取膀胱內(nèi)尿液，力度需輕防止損傷。之后可選擇生理鹽水或磷酸鹽緩沖液進行膀胱灌洗以提高實驗的可靠性[6]。換用新注射器將造模試劑CYP注入，灌注速度控制在2 μL/s可以防止損傷和膀胱輸尿管反流的發(fā)生[6]。

1.4 組織HE染色在灌注后第4周使用一次性活檢穿刺針在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部皮膚逐層穿刺至膀胱全層后，將穿刺的膀胱組織用40 g/L多聚甲醛溶液固定后梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片(5 μm)，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察膀胱炎癥情況。

1.5 組織甲苯胺藍染色將膀胱組織用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、包埋。石蠟切片經(jīng)甲苯胺藍液(甲苯胺藍0.2 g，體積分數(shù)為60%的乙醇50 mL)染色，脫水、透明，中性樹膠封片，并采用Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱組織HE染色對照組可以看到膀胱黏膜上皮完整，沒有明顯的損傷；實驗組在CYP刺激后可以看到膀胱黏膜上皮破壞、脫落，黏膜下層明顯增厚，炎癥細胞浸潤增多(圖1)，說明CYP造成的炎癥效果比較明顯。

A：對照組；B：實驗組。圖1 對照組和實驗組灌注后第4周穿刺膀胱組織(HE,×30)

2.2 肥大細胞特殊染色IC是一種慢性無菌性膀胱炎癥，其病理上無特異性表現(xiàn)，與一般膀胱慢性炎癥唯一的特征性區(qū)別是膀胱組織可見較多的肥大細胞，并呈脫顆粒表現(xiàn)[7-8]。因此本實驗用甲苯胺藍試劑檢測膀胱組織中脫顆粒肥大細胞的浸潤情況來檢驗犬模型能否達到預(yù)期結(jié)果。從圖2中我們可以看出，周圍組織背景清晰，實驗組與對照組相比肥大細胞浸潤明顯增多，紅色箭頭所指為肥大細胞。通過Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)軟件進行分析計算每平方毫米內(nèi)肥大細胞的數(shù)量(表1)。

A：對照組；B：實驗組。圖2 對照組和實驗組第4周穿刺膀胱組織(甲苯胺藍染色,×40)

表1 實驗組和對照組每平方毫米內(nèi)肥大細胞的數(shù)量

3 討 論

雖然當(dāng)前細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究方法高速發(fā)展，然而為了觀察和檢測機體的協(xié)調(diào)活動和整體狀態(tài)，使用動物模型模擬病理狀態(tài)的方法仍然是必不可少的[9]。在過去的幾十年，大約有20多種動物模型制備出來[4]，而以往報道了一些IC的實驗動物模型在制作上仍存在一些不足之處。例如，當(dāng)前較新穎的是通過向大鼠膀胱灌注10 mg硫酸魚精蛋白+750 μg脂多糖，但魚精蛋白這類物質(zhì)是非選擇性的，會破壞細胞膜，導(dǎo)致細胞裂解[10-11]；IZGI等[12-13]通過向小鼠注射UPK3A 65-84肽或偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)誘發(fā)主要的IC表型，其效果較好，但由于UPK3A 65-84肽制備成本較高，PRV穩(wěn)定性較差，因此未得到大面積推廣。盡管最常用的實驗動物鼠，從一定程度能模擬人體，但是對于IC膀胱內(nèi)藥物滴注模型而言，需要反復(fù)經(jīng)尿道灌注藥物，而鼠尿道狹窄，特別是小鼠從操作上來說有一定的操作難度及尿道狹窄可能[10]。貓科動物由于病因不明確，以及后期處理和維持的成本相對較高，因而使用受限[14]。再加上人類狀況本身的復(fù)雜性，幾乎現(xiàn)有動物模型都不能完全重現(xiàn)人類的所有癥狀，而只能更加接近地模擬IC的病理生理[14-15]。

對于IC模型，目前造模方式比較符合人們對于IC認知的是膀胱內(nèi)藥物滴注模型。這類模型通過導(dǎo)管或者導(dǎo)尿管直接將藥物送至膀胱，作用于膀胱黏膜引起炎癥，機理簡單，成本較低，能夠很好地還原人類IC的表型，但一般表型維持時間短，因此需要多次灌注[16]。而有研究表明，CYP作為最常用的造模藥物，反復(fù)給予低劑量CYP，可以很好地誘發(fā)IC患者的疼痛癥狀及下尿路癥狀，而不會出現(xiàn)出血等病理改變[17-18]。根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)報道，此類模型應(yīng)用最多，是一種經(jīng)過充分研究的模型，其在穩(wěn)定性及可操作性上具備獨特優(yōu)勢。因此本研究將造模藥物CYP與膀胱內(nèi)藥物灌注造模方式相結(jié)合。同時本文以犬作為實驗動物，既能夠誘導(dǎo)出慢性炎癥，延長表型維持時間，也能解決因小鼠尿道插管引起的尿道損傷、狹窄、炎癥及存在的技術(shù)問題，以及長期注射CYP后引起小鼠膀胱尿路上皮增生、改變等病理問題。在實驗中，我們還模擬膀胱穿刺診斷人類IC的過程，在將犬麻醉和皮膚消毒后，通過超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部皮膚逐層穿刺至膀胱全層，這樣使取得的膀胱組織更加符合人類組織活檢的臨床過程。

在本研究中，我們建立了一種新的IC動物模型，這種新的模型與人類IC的臨床和組織病理學(xué)特征非常相似，通過與對照組相比發(fā)現(xiàn)具有以下特點：膀胱壁全層慢性炎癥細胞浸潤，尿路上皮變薄或部分缺失，肥大細胞浸潤明顯。然而，實驗仍存在一些不足之處，例如使用一次性活檢穿刺針穿刺膀胱組織仍有取到其他組織的可能，這樣可能造成實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確或得出錯誤的數(shù)據(jù)。此外，由于穿刺針逐層取得的膀胱組織往往比較細小，因此做組織切片時層次可能被破壞，影響實驗的結(jié)果。犬作為實驗動物，雖然與鼠相比在操作上有一定優(yōu)勢，但犬的經(jīng)濟成本較高，且犬在實驗過程中不易控制，有一定危險性。我們在接下來的實驗中將對這些不足之處做進一步改進和優(yōu)化。

根據(jù)目前研究結(jié)果，犬膀胱內(nèi)CYP誘導(dǎo)的IC模型可能是一種相對持久的膀胱炎模型，能夠更好地反映膀胱炎的病理發(fā)生發(fā)展過程。因此，建立一種有效的IC/BPS模型對其潛在的治療方法的檢測具有重要意義。

本研究表明通過間歇性地向犬膀胱內(nèi)灌注CYP可誘導(dǎo)膀胱產(chǎn)生相對持久的炎癥，組織中慢性炎癥細胞浸潤，其中肥大細胞浸潤明顯，而且這種新的慢性膀胱炎模型與人類BPS的臨床和組織病理學(xué)特征有較高的相似度。因此，我們建立的CYP誘導(dǎo)的犬膀胱炎模型不僅能夠模擬膀胱穿刺診斷人類IC過程，而且也能更好地模擬人類IC的發(fā)生、發(fā)展過程，它有可能成為BPS等慢性膀胱炎的病理研究和診斷的一種潛在的有價值的模型。