皋月娟 王 菲 董小小 高文宏

肝臟是血管豐富且質(zhì)脆易碎的腹腔實質(zhì)性臟器，嚴(yán)重的肝臟損傷引起的失血性休克致死率高達(dá)4.0%～11.7%。有效控制損傷肝臟的出血可降低手術(shù)治療的難度，為臨床醫(yī)師和患者提供更好的治療條件。本課題組前期研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，在高聲壓超聲輻照的同時輔以血池內(nèi)脂質(zhì)微泡灌注，可引起肝細(xì)胞急性水腫，繼發(fā)的肝竇閉塞可顯著降低甚至?xí)簳r性阻斷肝臟局部的血流灌注，使出血量及出血速率顯著下降。上述高聲壓脈沖超聲輻照聯(lián)合血管內(nèi)微泡引起的超聲空化效應(yīng)致肝細(xì)胞水腫的病理改變明確，但其與肝細(xì)胞水腫相關(guān)蛋白之間的關(guān)系尚不明確。國內(nèi)外超聲治療研究［3-4］證實，低能量超聲治療可引起兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜上水通道蛋白（AQP）表達(dá)的降低、抑制兔骨骼肌ATP酶的活性。但上述研究均未采用微泡增強超聲作用，關(guān)于微泡增強的超聲空化作用對肝臟水分子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，目前尚未見相關(guān)研究。本實驗以此為基礎(chǔ)，采用高聲壓脈沖超聲聯(lián)合血管內(nèi)微泡注射對兔肝臟組織進行超聲輻照后，檢測兔腫脹肝臟組織中AQP 4及鈉鉀ATP酶（Na+-K+ATPase）表達(dá)量的變化，探索其與超聲輻照時間之間的關(guān)系，從而進一步了解超聲空化效應(yīng)對肝臟組織水腫影響的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物及分組

健康新西蘭大白兔41只，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗中心提供［許可證號：SYXK（渝）2017-0010］，雌雄不限，體質(zhì)量2～3 kg，3個月齡。將其隨機分為空白對照組（n=5）及不同輻照時間組：T1組（輻照時間1 min，n=12）、T5組（輻照時間5 min，n=12）及T10組（輻照時間10 min，n=12）。本實驗經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

二、儀器與試劑

1.主要儀器：使用CZ 960定制型脈沖式超聲發(fā)射儀（深圳市威爾德醫(yī)療電子有限責(zé)任公司），由主機、連接電纜及聲波發(fā)射探頭組成，發(fā)射脈沖式超聲波。

2.主要試劑：鹽酸塞拉嗪注射液（陸眠寧Ⅱ，吉林省華牧動物保健品有限公司），2%戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，P3761），兔抗AQP4多克隆抗體（ab156924）、鼠抗N+-K+ATPase單克隆抗體（ab7671）及辣根過氧化物酶標(biāo) 記 二 抗（ab205718、ab205719）均由美國Abcam公司生產(chǎn)，“脂氟顯”脂質(zhì)包膜微泡（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科自制）。

三、實驗方法

1.輻照前準(zhǔn)備：將健康新西蘭大白兔稱重后采用復(fù)合麻醉方法麻醉。肌注鹽酸塞拉嗪注射液0.3 ml/kg，待動物肌肉松弛后，經(jīng)耳緣靜脈建立靜脈通道，靜脈注射2%戊巴比妥鈉溶液約0.4 ml/kg，待動物角膜反射基本消失后，將其仰臥位固定于動物手術(shù)臺。腹部備皮，上至胸骨柄水平，下至劍突下10 cm處，兩側(cè)至腋前線處。局部皮膚以醫(yī)用碘伏溶液消毒，鋪一次性無菌手術(shù)巾。于劍突下沿腹中線逐層切開皮膚及腹壁肌肉寬約4 cm。將肝葉由腹壁切口輕輕拖出，置于腹壁上。

2.超聲輻照：選取暴露良好肝葉，將脈沖式超聲發(fā)射儀治療頭置于肝葉表面，探頭與肝葉間置充足無菌耦合劑并排出空氣以保證良好耦合。經(jīng)耳緣靜脈通道緩慢推注稀釋的脂質(zhì)微泡（0.2 ml/kg微泡以無菌生理鹽水稀釋至3 ml），同時按照分組分別輻照肝臟1 min、5 min、10 min。脈沖超聲參數(shù)設(shè)置為：工作波形采用正弦波，探頭頻率1.07 MHz，脈沖重復(fù)頻率100 Hz，有效脈沖寬度50μs，峰值負(fù)壓2 MPa，工作/間歇時間6 s/6 s。治療結(jié)束后取適量肝葉組織于-80°冰箱保存?？瞻讓φ战M動物僅采用相同方法麻醉后，開腹取適量肝葉組織于-80°冰箱保存。

3.免疫組織化學(xué)法觀察AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)：取待檢測肝組織，抗原修復(fù)后加入3%過氧化氫溶液避光孵育20 min，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗后加入3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min，先后加入一抗及二抗，PBS漂洗，DAB顯色液顯色，復(fù)染、脫水封片。低倍（×100）及高倍（×400）顯微鏡下觀察AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)分布情況，以細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

4.蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量：取-80°保存待檢測肝組織，研磨后加入勻漿液提取總蛋白，蛋白質(zhì)定量法進行蛋白濃度測定，蛋白上樣量為10μg，行十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%BSA封閉液，室溫?fù)u床搖動封閉1 h，加入一抗4℃過夜，抗體稀釋液洗膜3次，每次10 min，二抗室溫作用1 h，抗體稀釋液再次洗膜后，曝光及掃描。以GAPDH為參照，定量計算各組AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、超聲輻照后各組兔肝臟AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白分布

超聲輻照后，T1、T5、T10組肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度腫脹，表現(xiàn)為肝竇間隙變窄、消失，AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量均較空白對照組增加，表現(xiàn)為小葉邊緣及匯管區(qū)強陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增多、分布范圍廣泛。見圖1，2。

圖1超聲輻照后各組兔肝臟組織中AQP 4蛋白（箭頭示）表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖2超聲輻照后各組兔肝臟組織中Na+-K+ATPase蛋白（箭頭示）表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×100）

二、超聲輻照后各組兔肝臟AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量比較

超聲輻照后，T1、T5、T10組AQP 4蛋白表達(dá)量均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且T1、T10組AQP 4蛋白表達(dá)量與T5組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），T1組與T10組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；T5組和T10組Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照組和T1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），T5組與T10組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），T1組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1和圖3。

表1超聲輻照后各組兔肝臟AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量比較（±s）

表1超聲輻照后各組兔肝臟AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與T1組比較，#P＜0.05；與T5組比較，△P＜0.05。AQP 4：水通道蛋白4；Na+-K+ATPase：鈉鉀ATP酶；GAPDH：內(nèi)參

組別空白對照組T1組T5組T10組F值P AQP 4/GAPDH 0.20±0.01 0.26±0.03*0.34±0.04*#0.27±0.05*△13.751＜0.05 Na+-K+ATPase/GAPDH 0.23±0.03 0.26±0.04 0.34±0.05*#0.30±0.03*#△9.425＜0.05

圖3 Western Blot檢測超聲輻照后各組兔肝臟AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量

討 論

空化效應(yīng)是超聲的主要生物學(xué)效應(yīng)之一，指液體中的微氣泡在聲壓作用下產(chǎn)生的周期性震蕩、膨脹甚至內(nèi)爆的過程［5］。當(dāng)體內(nèi)含有大量外源性空化核（如微泡造影劑）時，空化的閾值降低、強度增加［6］。微泡增強超聲空化效應(yīng)已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，目前相關(guān)研究方向包括超聲空化溶栓［7］、止血［8］、腫瘤物理療法［9］、基因轉(zhuǎn)染［10］等。Zhao等［2］研究證實，高聲壓脈沖超聲輻照聯(lián)合血管內(nèi)脂質(zhì)微泡注射可產(chǎn)生血流阻斷效應(yīng)，引起輻照區(qū)域肝細(xì)胞急性水腫及繼發(fā)性肝竇閉塞，該效應(yīng)對肝臟的急性止血效果佳。在此基礎(chǔ)上，本課題組前期研究［1］對空化效應(yīng)致肝細(xì)胞腫脹的相關(guān)聲脈沖參數(shù)進行了深入探討，發(fā)現(xiàn)高峰值聲壓（2 MPa）脈沖超聲輻照正常兔肝臟后，輻照區(qū)域肝組織腫脹，超聲造影顯示其血流灌注量下降、血流速度減緩，該處血流下降效應(yīng)隨時間延長逐漸恢復(fù)。

值得注意的是，上述實驗設(shè)置了1min、5min及10min 3個不同時長的超聲輻照組，其輻照時間最長相差10倍，然而造影結(jié)果卻證實，超聲輻照時間的長短對血流下降效應(yīng)無顯著影響?？紤]到各組間累積聲能量有顯著差異，因此本實驗進一步觀察了微觀層面上細(xì)胞水分子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

AQP和Na+-K+ATPase均為維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡的重要分子。AQP是一組對水有高選擇性的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，在細(xì)胞膜上形成四聚體，每個單體均包含一個獨立的水性孔道［11］，其所介導(dǎo)的自由水快速被動的跨生物膜轉(zhuǎn)運是水進出細(xì)胞的主要通道，缺血及細(xì)胞內(nèi)外離子分布的失衡均可上調(diào)組織內(nèi)AQP 4蛋白的表達(dá)［12］，從而引起水分子進入細(xì)胞內(nèi)增多，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。Na+-K+ATPase存在于真核細(xì)胞膜上，主要功能為調(diào)節(jié)鈉離子、鉀離子的跨膜轉(zhuǎn)運，維持正常情況下細(xì)胞內(nèi)外鈉、鉀離子的濃度梯度，從而保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡［13］。本實驗經(jīng)免疫組織化學(xué)觀察及Western Blot檢測結(jié)果顯示，微泡注射聯(lián)合高聲壓脈沖超聲輻照后，輻照區(qū)域肝細(xì)胞均表現(xiàn)為不同程度的腫脹，且各超聲輻照時間組AQP 4蛋白表達(dá)量，以及T5組和T10組Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量均較空白對照組顯著升高（均P＜0.05），提示高聲壓脈沖超聲空化作用可引起肝細(xì)胞水平衡相關(guān)蛋白表達(dá)量的增加。推測其原因為在高聲壓脈沖超聲輻照下，血池內(nèi)微泡產(chǎn)生的強烈瞬態(tài)空化作用會引起鄰近細(xì)胞膜的空化損傷，導(dǎo)致聲孔形成，引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓和離子濃度的失衡，從而上調(diào)AQP 4及Na+-K+ATPase的蛋白表達(dá)量。

進一步的組間比較結(jié)果顯示，當(dāng)輻照時間僅為1 min時（T1組），AQP 4蛋白表達(dá)量（0.26±0.03）較空白對照組（0.20±0.01）即已顯著升高（P＜0.05）；輻照時間延長為5 min時（T5組），其表達(dá)量進一步升高（0.34±0.04），與T1組和空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而當(dāng)輻照時間為10 min時（T10組），AQP 4表達(dá)量（0.27±0.05）較T5組反而有所降低，與T1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其蛋白表達(dá)隨輻照時間延長呈先升后降的趨勢。與AQP 4相似，Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量也隨輻照時間延長呈先升后降的趨勢，在輻照時間為5 min時（T5組）蛋白表達(dá)量（0.34±0.05）較對照組顯著升高（P＜0.05），輻照10 min時（T10組）其表達(dá)量（0.30±0.03）亦有所降低，且與T5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明超聲輻照時間的長短對AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量的影響不同。結(jié)合前期研究［1］結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻照僅1 min的高聲壓脈沖超聲輻照不僅可引起肝臟組織顯著腫脹、血流灌注量下降、血流速度減緩，同時可上調(diào)AQP 4的表達(dá)。隨著輻照時間的延長，肝臟組織血流灌注量變化無顯著差異，但AQP4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量有顯著變化，在輻照5 min時（T5組）蛋白表達(dá)量較空白對照組及T1、T10組均顯著升高（均P＜0.05）。推測可能與肝臟特殊的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。聲孔效應(yīng)動力學(xué)研究［14］表明，微泡震蕩所誘導(dǎo)的聲孔效應(yīng)程度取決于微泡到細(xì)胞之間的距離，且當(dāng)微泡與細(xì)胞間距離＜5.5μm時，微泡的數(shù)量與聲孔效應(yīng)的程度呈正相關(guān)，隨著微泡空化數(shù)量的增多，聲孔效應(yīng)由可逆轉(zhuǎn)為不可逆。肝臟作為人體重要的代謝器官，為了保證快速充分的物質(zhì)交換與代謝，肝細(xì)胞排列為肝板，每個肝細(xì)胞均有兩個面緊鄰肝血竇的毛細(xì)血管，使得進入血液循環(huán)的微泡可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞緊鄰，因此空化效應(yīng)容易在肝細(xì)胞膜上產(chǎn)生聲孔，短時間的超聲輻照即可引起肝細(xì)胞內(nèi)外的離子失衡，從而引起顯著的水平衡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)和肝細(xì)胞腫脹。然而由于肝細(xì)胞排列緊密、組織間質(zhì)成分少，因此其腫脹程度有限，即使輻照時間延長，其腫脹程度及組織血流灌注量亦無顯著差異。然而對于水平衡相關(guān)蛋白而言，長時間的組織灌注缺血狀態(tài)可能導(dǎo)致細(xì)胞進一步缺氧，反而使蛋白表達(dá)量降低。提示長時間的高聲壓脈沖超聲輻照可能引起組織代償調(diào)節(jié)能力的下降。

綜上所述，微泡聯(lián)合高聲壓脈沖超聲輻照可顯著上調(diào)肝臟組織內(nèi)兩種水分子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白AQP 4和Na+-K+ATPase表達(dá)量，且輻照時間對蛋白表達(dá)量有影響，輻照1 min即可顯著上調(diào)水通道蛋白表達(dá)量，隨著輻照時間的進一步延長，AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表達(dá)量呈先升后降的趨勢。但本實驗未進一步探索上述水平衡相關(guān)蛋白表達(dá)量與肝臟組織腫脹程度間的關(guān)系；此外，未檢測肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且未進一步闡述輻照時間長短對肝細(xì)胞損傷的影響作用。待以后實驗研究的進一步完善。