莫一嘯，王楨，王盼，沈樹紅，2

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心 血液腫瘤科，上海 200127

白血病是兒童惡性腫瘤疾病中最高發(fā)的疾病，發(fā)病率近4/10萬，其中急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）約占白血病患兒的70%[1-3]。近年來以危險(xiǎn)度分層為指導(dǎo)的規(guī)范化治療不斷完善與改進(jìn)，使得兒童ALL成為最可治愈的癌癥[4]。在我國，據(jù)SCMC-ALL-2005臨床研究報(bào)道，兒童ALL 5年生存率達(dá)80%[5]。盡管如此，ALL對每一個(gè)患兒及其家庭的影響和壓力仍巨大。最根本的解決辦法是防止ALL的發(fā)生，而預(yù)測ALL的發(fā)生是預(yù)防的基礎(chǔ)。近年來，隨著高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展，為患兒生殖系細(xì)胞的遺傳變異即遺傳多態(tài)性的檢測提供了平臺(tái)。結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）更全面地揭示了人群間白血病易感性、預(yù)后與治療藥物毒性反應(yīng)程度差異的原因[6-7]。

關(guān)于遺傳多態(tài)性與ALL易感性的關(guān)系，一方面通過對腫瘤發(fā)病相關(guān)的候選基因多態(tài)性位點(diǎn)角度，如ABCB1、MTHFR、FAS、FASL、CASP8、TERT、FOXO3、MMP等基因[8-15]。但這種通過候選基因的方法，通常只聚焦于特定基因，而不能全面系統(tǒng)公正地評價(jià)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點(diǎn)多態(tài)性與疾病的關(guān)系。在GWAS研究中，通過對大量的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型，并設(shè)置非常高的有意義標(biāo)準(zhǔn)，從而能篩選出可靠的兒童ALL易感性位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，2009年有研究進(jìn)行了兩個(gè)針對所有ALL類型的全基因組關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)21個(gè)兒童ALL易感性位點(diǎn)[16-17]。而SNPs具有人群特異性，在上述21個(gè)GWAS報(bào)道的兒童ALL易感性位點(diǎn)中，僅位于ARID5B基因的rs10821936、rs10994982，位于IKZF1的rs4132601及位于CEBPE基因的rs2239633在中國人群中進(jìn)行過驗(yàn)證[18-19]，而其余位點(diǎn)均未見中國人群的報(bào)道。本課題組根據(jù)上述基于歐美人群的2個(gè)GWAS報(bào)道的兒童ALL易感性位點(diǎn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件選取了13個(gè)候選位點(diǎn)，期望用我國人群驗(yàn)證這些SNP位點(diǎn)是否提示中國人群ALL的發(fā)病。

1 對象和方法

1.1 對象 以2008年至2017年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院收治的ALL患兒191例為病例組。以191例健康志愿者為對照組。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號：LCKY2019-05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提?。篈LL患兒緩解期骨髓涂片及對照組志愿者口腔拭子分別采用QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司，cat.no.51306）和北京天根公司口腔拭子基因組DNA提取試劑盒（cat.no.DP322）抽提基因組DNA。

1.2.2 SNPs分型檢測：基因分型方法參照美國Fluidigm公司提供的“Genotyping with Juno”說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡要實(shí)驗(yàn)步驟如下：采用美國 Fluidigm公司定制的待測SNP位點(diǎn)靶向擴(kuò)增引物，用Fluidigm公司定制的微流體動(dòng)態(tài)芯片在JunoTM分析系統(tǒng)儀器上采用Juno96.96格式下進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因型檢測。收集到的數(shù)據(jù)在Fluidigm SNP Genotyping Analysis software v4.2上進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS24.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示；對對照組進(jìn)行Hardy-Weinbreg平衡檢檢，以P＞0.05為樣本處于Hardy-Weinbreg平衡狀態(tài)；病例組及對照組基因型分布和等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性與ALL的關(guān)系采用logistic回歸分析計(jì)算OR 及95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 對對照組標(biāo)本13個(gè)位點(diǎn)（見表1）進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，rs10849033的P值＜0.001，表明存在偏離，故將該位點(diǎn)剔除。其余位點(diǎn)均P＞0.05，表明不存在顯著偏離（見表2）。

2.2 13個(gè)SNPs位點(diǎn)與兒童ALL的關(guān)系 病例組及對照組的基因型分布，等位基因頻率及與兒童ALL易感性的關(guān)系見表3。病例組與對照組基因型分布存在差異的位點(diǎn)有位于ARID5B基因的rs10821936（P=0.001），位于IKZF1 基因的rs11978267（P ＜0.001）和rs4132601（P=0.001），位于KRTH5B基因的rs2089222（P=0.047），位于ZNF230 基因的rs2191566（P=0.003）。通過χ2檢驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因在病例組與對照組的分布差異，病例組位于ARID5B基因的rs10821936位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因C頻率明顯高于病例組（P＜0.001），rs10994982位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因A頻率高于病例組（P=0.016）。位于IKZF1基因的rs11978267風(fēng)險(xiǎn)等位G頻率及rs4232601風(fēng)險(xiǎn)等位基因G頻率病例組均高于對照組（P=0.001，0.003）。病例組位于ZNF230基因的rs2191566位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因C頻率明顯高于對照組（P=0.002）。

表1 候選SNPs位點(diǎn)信息

表2 對照組Hardy-Weinbreg平衡檢檢

通過logistic回歸分析各基因型與兒童ALL易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示：位于ARID5B 基因的rs10821936位點(diǎn)CC基因型發(fā)生ALL的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的3.192倍（95%CI=1.697～6.006），該位點(diǎn)攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因C患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是T的1.692倍（95%CI= 1.265～2.264）。rs10994982位點(diǎn)AA基因型患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的2.022 倍（95%CI=1.131～3.614），該位點(diǎn)攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因A患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是G的1.425倍（95%CI=1.068～1.901）。位于IKZF1基因的rs11978267位點(diǎn)GA基因型患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的2.584倍（95%CI=1.599～4.176），該位點(diǎn)攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因G發(fā)生ALL的風(fēng)險(xiǎn)是A的1.965倍（95%CI=1.301～2.968）。rs4132601位點(diǎn)GT基因型患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的2.417倍（95%CI=1.478～3.952），該位點(diǎn)攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因G患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是T的1.871倍（95%CI=1.225～2.857）。位于ZNF230基因的rs2191566位點(diǎn)，基因型CA患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是AA的2.834倍（95%CI=1.302～6.169），CC基因型患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是AA的3.648倍（95%CI=1.688～8.041），攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因C的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是A的1.599倍（95%CI= 1.179～2.169）。

表3 12個(gè)SNPs位點(diǎn)與ALL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

續(xù)表3

3 討論

2009年TREVI?O等[16]報(bào)道的基因組研究，揭示了ARID5B 基因中的SNPs位點(diǎn)rs10821936 及rs10994982與白血病易感性的相關(guān)性，且在驗(yàn)證人群中還發(fā)現(xiàn)了這2 個(gè)位點(diǎn)與超二倍體型急性B系淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病相關(guān)。2013 年有研究對rs10821936在中國兒童ALL與健康人群中進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)該位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因T確實(shí)與兒童ALL發(fā)病相關(guān)，且與超二倍體型B-ALL的發(fā)病也相關(guān)[18]。2019年有研究對rs10994982位點(diǎn)在中國兒童ALL及健康人群中的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證，也得到了同樣的結(jié)論[19]。本研究再次驗(yàn)證了這2個(gè)SNPs位點(diǎn)與中國兒童ALL易感性的關(guān)系，但因病例資料收集不完善，無法進(jìn)一步驗(yàn)證上述兩位點(diǎn)與超二倍體型B-ALL的關(guān)系。

IKZF1 基因變異在白血病發(fā)病過程中起重要作用。其體細(xì)胞突變會(huì)造成轉(zhuǎn)錄因子IKAROS編碼異常，造成造血細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，超表達(dá)黏附分子等，且往往與不良預(yù)后有關(guān)[20-21]。生殖系遺傳變異則往往與白血病易感性相關(guān)，TREVI?O等[16]與PAPAEMMANUIL等[17]的GWAS研究中分別報(bào)道了位于IKZF1 基因上的白血病易感性相關(guān)SNPs位點(diǎn)rs11978267與rs4132601。此前的研究結(jié)果中，未發(fā)現(xiàn)rs4132601與中國人群兒童ALL易感性的關(guān)系[18]。 本研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的基因型分布及風(fēng)險(xiǎn)等位基因G在病例組與對照組中存在差異，且基因型GT患ALL的風(fēng)險(xiǎn)是基因型TT的2.417倍，攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因G的患ALL風(fēng)險(xiǎn)是T的1.871。但純合基因型GG因病例數(shù)少不能得到更加肯定的結(jié)論，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量為該位點(diǎn)與中國兒童ALL易感性的相關(guān)性提供更有說服力的證據(jù)。位于IKZF1 的另一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs11978267，此前在歐洲人群、突尼斯人群、也門人群及伊朗人群中被報(bào)道為兒童ALL易感性位點(diǎn)[16，22-23]。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)rs11978267的基因型分布及風(fēng)險(xiǎn)等位基因G的頻率在病例組及對照組中存在差異，且基因型GA相對于基因型AA及攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位基因G相對于A都有較高的患ALL風(fēng)險(xiǎn)，OR＞1.9。但風(fēng)險(xiǎn)等位基因G的純合基因型GG因病例數(shù)少，無法得到肯定的結(jié)論，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

ZNF230基因上的rs2191566被國外多個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)分析報(bào)道與白血病易感性相關(guān)[16，24-25]，但該位點(diǎn)與中國人群兒童ALL的關(guān)系未見報(bào)道。本研究中我們得到其在病例組及對照組中基因型分布、風(fēng)險(xiǎn)等位基因C的頻率存在差異，且基因型CA、CC的ALL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于AA，因此我們認(rèn)為該位點(diǎn)是中國人群的兒童ALL易感性位點(diǎn)。位于KRTH5B基因的rs2089222位點(diǎn)，雖然在本次試驗(yàn)中其基因型分布存在差異，但未看到風(fēng)險(xiǎn)等位基因頻率存在差異且各基因型未明顯增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，因此不認(rèn)為該位點(diǎn)為中國兒童ALL易感性位點(diǎn)。

2013 年南京兒童醫(yī)院的一項(xiàng)570 例ALL患兒與673 例健康兒童人群的病例對照研究對歐美人群易感性相關(guān)的ARID5B（rs10821936）、IKZF1（rs4132601）及CEBPE（rs2239633）進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與歐洲兒童人群ALL易感性相關(guān)的CEBPE 基因的rs2239633位點(diǎn)在中國人群中未發(fā)現(xiàn)與ALL相關(guān)，在我們的試驗(yàn)中也未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與白細(xì)胞易感性的相關(guān)性。南京兒童醫(yī)院分析其原因可能與中國人群在該位點(diǎn)上的表達(dá)連鎖不平衡有關(guān)，通過LD矩陣圖分析rs2239633所處的LD blocks在兩個(gè)人群中明顯不同[18]。

位于LOC102723724 基因的rs11155133位點(diǎn)，SIAT7C 基因的rs10873876 位點(diǎn)，KCNE4 基因的rs12621643位點(diǎn)，RYR2 基因的rs7554607位點(diǎn)及 KCNMB2基因的rs9290663位點(diǎn)在2009年的多協(xié)作組大樣本量基因組研究中報(bào)道為ALL易感性位點(diǎn)，而在本次試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其與白血病的相關(guān)性，這可能與樣本量有限及中國人群中這些位點(diǎn)的表達(dá)差異有關(guān)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證[16]。

本試驗(yàn)驗(yàn)證了此前鮮有中國內(nèi)地人群報(bào)道的兒童ALL易感性位點(diǎn)，位于ZNF230基因的rs2191566。同時(shí)我們再次驗(yàn)證了已報(bào)道的位于基因ARID5B的中國人群ALL易感性位點(diǎn)rs10821936及rs10994982。此外根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為位于IKZF1 基因的rs4132601及rs11978267為潛在中國人群兒童ALL易感性位點(diǎn)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證。

綜上所述，本研究明確了3 個(gè)ALL遺傳易感位點(diǎn)，這為白血病的診斷、治療及預(yù)防工作提供了一定的思路。隨著基因組研究的不斷深入，可遺傳變異導(dǎo)致的某些疾病易感性被越來越多的數(shù)據(jù)所證實(shí)。如何利用這些數(shù)據(jù)來預(yù)測其患病的風(fēng)險(xiǎn)是下一個(gè)突破的課題。同時(shí)很多易感性位點(diǎn)所在基因與疾病治療藥物敏感性也相關(guān)，進(jìn)一步通過藥物基因組學(xué)的研究能為白血病的診治提供新思路[26]。