狄楓，吳秀娟，沈水娟，郭波堯

紹興市人民醫(yī)院，浙江 紹興 312000，1.呼吸科；2.腎內(nèi)科

血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、慢性腎臟?。╟hronic kidney dielace，CKD）等多種疾病的共同病理生理過程。在腎小球?yàn)V過率降低的CKD患者中，血管鈣化發(fā)生率可達(dá)89%[1]。CKD患者的血管鈣化并不是簡單的鈣磷被動(dòng)沉積過程，而是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）在CKD環(huán)境中經(jīng)歷凋亡和囊泡形成，并向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣化蛋白表達(dá)，基質(zhì)形成并吸收鈣磷沉積的主動(dòng)過程[2]。在這一過程中，血管鈣化是鈣化促進(jìn)因素和抑制因素不平衡的結(jié)果。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3 聯(lián)合尼古丁（vitamin D3 and nicotine，VDN）血管鈣化模型的大鼠在停止藥物干預(yù)后，血管鈣化可發(fā)生自行消退，在這一過程中，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）基因高表達(dá)[3]。為此，本研究通過采用克隆編碼ENPP1蛋白cDNA并構(gòu)建其重組腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus vector，AVV），以便為后續(xù)研究其在血管鈣化抑制中的作用及基因治療提供技術(shù)條件。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 主要試劑：DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Takara，日本）；高純度質(zhì)粒小量中提試劑盒（北京天根生化有限公司）；DNA引物合成（上海捷瑞公司）；Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒（Qiagen，德 國）；DNA內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶（DNA marker，上海賽默飛）；DNA凝膠回收試劑盒（Omega，美國）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Axygen，美國）；Pav-fh AAV9載體（Vigenebio，美國）。主要儀器：全波長酶標(biāo)儀、超微量高精度分光光度計(jì)、落地式培養(yǎng)搖床（美國Thermo公司）；超速離心機(jī)（日本Hitachi）；pH計(jì)（德國Mettler toledo公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus）；實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad）；熒光顯微鏡（日本Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo）； 超凈工作臺(tái)、生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 克隆大鼠ENPP1基因大片段：提取8周齡雄性SD大鼠的血管中膜平滑肌組織。確定大鼠目的基因ENPP1，NM053535.1；序列全長2 721 bp。設(shè)計(jì)引物：正向GCGTGAATTCGCCACCATGGAGCGCGACG；反向 GCGTACGCGTGTCTTCTTGGCTGAAGATTGGT。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。模板：大鼠血管中膜平滑肌原代細(xì)胞cDNA。收到引物后瞬時(shí)離心，將引物干粉加水稀釋成100 μmol/L的母液，再轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，稀釋10倍成為PCR工作液。應(yīng)用RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增ENPP1基因。RT-PCR反應(yīng)條件為：首先42 ℃ 30 min，98 ℃變性3 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后98 ℃變性20 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次，再72 ℃延伸5 min，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA純化試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.2 構(gòu)建克隆質(zhì)粒：將純化PCR產(chǎn)物BamH I和EcoR I酶切后定向連接到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPT2A-Puro（CD513B-1）載體中，構(gòu)建pCDH-ENPP1重組質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α構(gòu)建克隆質(zhì)粒。步驟如下：將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混勻后冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，即置冰上 5 min，加入預(yù)熱至室溫的400 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 恒溫?fù)u床200 r/min培養(yǎng)1 h，離心棄上清液后用移液器混勻后均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37 ℃倒置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶鑒定后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.3 重組pAAV/ENPP1質(zhì)粒的構(gòu)建：用EcoR I/Xho I分別對腺相關(guān)病毒空載體pAAV-MCS和pCDHENPP1重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切目的條帶大小，膠回收目的基因酶切片段，T4 DNA連接酶將目的片段與載體片段22 ℃連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將制備好的DH5α感受態(tài)置于冰浴中，待DH5α感受態(tài)細(xì)胞融化后，取1 μL連接產(chǎn)物于20 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰浴中靜置30 min。放入 42 ℃水浴鍋中40 s然后快速移至冰浴中，靜置 2 min。向離心管中加入200 μL無菌LB培養(yǎng)基混勻后置于搖床中37 ℃，200 r/min，振搖1 h。涂布到含氨芐青霉素抗性的固體培養(yǎng)基平皿中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。將pAAV-MCS空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)染VSMC作為陰性對照。

1.2.4 重組pAAV/ENPP1質(zhì)粒的篩選與鑒定：經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒通過PCR和EcoR I/Xho I酶切鑒定陽性克隆，測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與Gen Bank中所報(bào)道目的基因序列進(jìn)行比對分析。

1.2.5 病毒包裝：構(gòu)建好的病毒載體和輔助質(zhì)粒用Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行大量抽提，保證濃度大于1 μg/μL，A260/A280 1.7～1.8，用以包裝病毒。準(zhǔn)備HEK-293T細(xì)胞，提前1 d將HEK-293T細(xì)胞按照5.0×105細(xì)胞/孔的密度接種到孔板中，包裝時(shí)細(xì)胞密度85%～90%且細(xì)胞分布均勻，狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染前1～2 h給細(xì)胞換液為無血清的DMEM培養(yǎng)基（1% HEPES和1% P/S）。轉(zhuǎn)染：配制包裝mix，轉(zhuǎn)染試劑、包裝質(zhì)粒、載體質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒的比例為15:2:2:1。室溫靜置30 min。將靜置后的液體加到HEK-293T細(xì)胞中搖晃混勻。將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收集病毒。收集病毒：將細(xì)胞吹起，與培養(yǎng)基一并收到50 mL離心管中。離心分離細(xì)胞沉淀及上清液。將培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移到新管中，PGE8000沉淀過夜。離心去上清液，將細(xì)胞沉淀用PBS+0.001% PF68重懸。凍融1次后加入5 mmol/L NaCl 1 mL，渦旋混勻，將重懸液振蕩混勻后超聲至不黏稠。將超聲后的液體3 500×g離心30 min，收集上清液。純化：配置不同濃度的碘克沙醇，密度梯度離心。超速離心純化病毒。濃縮：收集病毒，置于超濾管中對病毒進(jìn)行濃縮。吸10 μL病毒液進(jìn)行滴度檢測及特異性檢測。吸取病毒液用96 孔板轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞24 h。病毒滴度測定：腺相關(guān)病毒用蛋白酶K（5 μg/μL）處理破除病毒外殼，q-PCR法檢測病毒滴度。設(shè)立5個(gè)梯度稀釋濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，將超純水作為陰性對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品拷貝數(shù)。病毒顆粒數(shù)（個(gè)/mL）=與標(biāo)準(zhǔn)品相對值×10 000。

1.2.6 重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染VSMC：將目的細(xì)胞VSMC接種于96孔板，加入梯度稀釋病毒原液，轉(zhuǎn)染VSMC觀察細(xì)胞形態(tài)以摸索最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）。取正常生長的P4代VSMC，消化接種于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，將最佳MOI病毒液加入VSMC，混勻，37 ℃小體積轉(zhuǎn)染96 h。

1.2.7 Western blot檢測VSMC ENPP1蛋白的表達(dá)：蛋白樣品制備：使用細(xì)胞裂解液，對VSMC進(jìn)行裂解。然后BCA法測定蛋白濃度。測定562 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠，電泳30 min。轉(zhuǎn)膜：將PVDF膜在甲醇中浸泡約30 s，再在轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10 min，與濾紙、凝膠一起放入緩沖液中200 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)移。封閉：PVDF膜去離子水洗滌后浸入封閉液，置搖床上室溫封閉1 h。孵育一抗：取出已封閉的PVDF膜，浸于1×TBST緩沖液中，洗滌5 min，然后移入含有一抗的孵育盒中，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜。 孵育二抗：將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含二抗的抗體孵育盒孵育1 h后洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光顯影：將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。

2 結(jié)果

圖1 目的基因ENPP1 PCR產(chǎn)物的純化

圖2 酶切重組質(zhì)粒載體

圖3 菌落PCR鑒定陽性克隆

2.1 大鼠ENPP1基因大片段的克隆與鑒定 在RTPCR反應(yīng)中首先對PCR的退火溫度進(jìn)行梯度篩選，發(fā)現(xiàn)在退火溫度為64 ℃時(shí)可以擴(kuò)增出較特異的DNA片段，所得PCR產(chǎn)物大小約2 720 bp，與目的片段大小一致（見圖1）。隨后將該P(yáng)CR產(chǎn)物與pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP-T2A-Puro載體進(jìn)行連接，酶切結(jié)果顯示目的片段成功克隆至pCDH載體中（見圖2），重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取單 菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克?。ㄒ妶D3）。2.2 重組pAAV/ENPP1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)過EcoR I/Xho I酶切、連接、轉(zhuǎn)化和氨芐青霉素抗性篩選，LB平板上有數(shù)十個(gè)可疑克隆生長，提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoR I/Xho I酶切和PCR擴(kuò)增鑒定，共獲得3個(gè)陽性重組質(zhì)粒pAAV/ENPP1。測序結(jié)果顯示，3個(gè)質(zhì)粒與基因庫BLAST比對（見圖4）為序列一致的大鼠ENPP1全長cDNA，同源性100%，E值達(dá)8×10-98，且開放讀碼框完全正確（見圖5），表明大鼠VSMC ENPP1重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建成功。重組pAAV/ENPP1質(zhì)粒用HEK-293T細(xì)胞包裝。重組腺相關(guān)病毒滴度測定：q-PCR檢測病毒滴度，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，5個(gè)梯度稀釋濃度分別為4.51×1011、3.73×1010、3.26× 109、5.57×108、4.31×107，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖6），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品相對值。最終獲得ENPP1基因腺相關(guān)病毒滴度為2.79×1014v.g./mL。

2.3 rAAV/ENPP1轉(zhuǎn)染VSMC后ENPP1表達(dá)情況 病毒轉(zhuǎn)染組ENPP1蛋白表達(dá)較空白對照組高（見圖7）。

圖4 目的基因序列測序圖

3 討論

ENPP1屬于ENPP酶家族，是一種具有核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶活性的II型跨膜糖蛋白。ENPP1基因突變在人類可導(dǎo)致一種罕見的嚴(yán)重常染色體隱性遺傳疾病——嬰兒泛發(fā)性動(dòng)脈鈣化（generalized arterial calcification in infancy，GACI），特點(diǎn)是發(fā)生廣泛中型肌性動(dòng)脈鈣化，病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患兒因心衰死于嬰兒期[4]。敲除大鼠ENPP1基因可制作GACI動(dòng)物模型，而給ENPP1基因敲除大鼠皮下注射ENPP1融合蛋白（小鼠ENPP1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合人IgG1 Fc段）可明顯減輕GACI模型小鼠的血管鈣化，降低死亡率，以及心肌梗死及后遺癥發(fā)生率[5]，提示其在抑制血管鈣化中具有非常重要的作用。

圖5 基因序列BLSAT比對

圖6 ENPP1病毒液qPCR擴(kuò)增曲線圖

圖7 ENPP1 Western blot條帶圖

ENPP1廣泛參與核苷酸循壞、焦磷酸水平調(diào)控、磷脂信號(hào)調(diào)控、胰島素受體調(diào)控及胞外激酶活性。ENPP1可通過水解胞外ATP中的5，磷酸二酯鍵生成AMP和焦磷酸（PPi），后者可防止非晶態(tài)磷酸鈣的成核，還能抑制晶體向羥基磷灰石方向生長，并通過與羥基磷灰石表面結(jié)合形成不規(guī)則晶體而抑制晶體生長，有效預(yù)防病理性組織鈣化。ENPP1Q等位基因與主動(dòng)脈弓鈣化增加有關(guān)[6]。有研究認(rèn)為ENPP1可作為評價(jià)非糖尿病患者冠心病的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。因此我們認(rèn)為ENPP1在慢性腎臟病、心血管病所致的血管鈣化中也起著重要作用，是一個(gè)礦化調(diào)節(jié)的重要基因。目前，臨床上對于血管鈣化尚無特異性的治療方法，或許可通過ENPP1基因治療對血管鈣化進(jìn)行有效救治。

此外，病毒載體的選擇也是基因治療的關(guān)鍵。近年來，國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因治療血管性疾病進(jìn)行了深入研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，常選擇腺病毒載體，其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)時(shí)間較為短暫，不適合血管鈣化這種慢性疾病的防治。與腺病毒相比，AAV攜帶的外源基因可以長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，而且它引起的免疫反應(yīng)輕微。AAV屬于細(xì)小病毒家族，是一類無包膜的復(fù)制缺陷病毒，可以通過基因工程技術(shù)將DNA傳遞給靶細(xì)胞，是一個(gè)非常穩(wěn)定的載體，能夠承受廣泛的溫度和pH變化，幾乎沒有喪失活性[8]，已被證明是最有希望的人類基因治療的病毒載體之一[9]。重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，AAV中與復(fù)制和包裝相關(guān)的erp和cap基因被替換為ITRs間的基因，使rAAV具有4.1～4.9 kb的包裝容量。rAAV由多個(gè)質(zhì)粒組成，包括cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、erp/cap質(zhì)粒，它們之間不具有同源性序列，故rAAV不具有復(fù)制能力，復(fù)制過程依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶，因此避免通過重組而恢復(fù)出野生型病毒，宿主的免疫源性被降到最低。rAAV進(jìn)入細(xì)胞后，作為附加的DNA能穩(wěn)定存在，因此能長期表達(dá)外源基因，基因表達(dá)可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月。rAAV是基因傳遞和表達(dá)的一個(gè)重要工具，本研究應(yīng)用rAAV成功包裝出具有2 721 bp的ENPP1大容量基因片段。目前AAV有12種血清型，不同的血清型有不同的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識(shí)別與結(jié)合細(xì)胞表面受體也相應(yīng)有很大的差別。根據(jù)不同血清型轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)染效率，AAV-9轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞具有獨(dú)特的能力，AAV-1和AAV-9在向骨骼肌和心肌傳遞基因方面表現(xiàn)得非常有效[9]，AAV-2/9作為載體可在不引起炎癥的情況下有效地傳遞冠狀動(dòng)脈和外周動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的基因[10]。本實(shí)驗(yàn)選用AAV-9血清型作為載體轉(zhuǎn)染VSMC，Western blot顯示轉(zhuǎn)染目的基因后目的蛋白ENPP1高表達(dá)，提示AAV-9血清型可作為研究VSMC基因表達(dá)的載體。

總之，本研究選用AAV載體AAV-9 作為研究ENPP1的載體，在獲得編碼大鼠VSMC ENPP1的全長cDNA后，通過分子生物學(xué)技術(shù)將其裝載至AAV載體rAAV-MCS中，最終通過酶切鑒定和DNA測序證實(shí)成功構(gòu)建了序列信息完全正確的ENPP1重組AAV表達(dá)載體。