石哲瑋，劉勝新，秦鋮璠，章柳萍，錢(qián)彩珍

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬諸暨醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 紹興 311800；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.諸暨市中醫(yī)醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 紹興 311800

高血壓腎病初期主要表現(xiàn)為腎小管稀釋功能減退，隨著疾病的不斷進(jìn)展，大量正常的腎單位受到破壞，引起腎臟彌漫性纖維化以及慢性腎功能不全，最終引起腎臟硬化萎縮[1]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是導(dǎo)致高血壓腎病患者腎小管濃縮和稀釋功能下降的重要原因之一，同時(shí)也是誘導(dǎo)腎臟纖維化的重要病理過(guò)程[2]。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中重要的血管活性成分，是促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT改變以及腎臟纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3]。給予體外培養(yǎng)的NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞適宜濃度的Ang II處理可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變[4]。因此，本研究通過(guò)給予體外培養(yǎng)的NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞Ang II處理誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程，從而構(gòu)建高血壓腎病細(xì)胞模型。

miRNA是短的單鏈RNA序列，在生物系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，其主要作用為調(diào)控基因在多種生理和發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)[5]。既往研究表明miR-155在多種心血管相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。WANG等[6]的研究表明，下調(diào)miR-155表達(dá)可以保護(hù)C57BL/6小鼠免受脂多糖感染引起的心臟功能障礙并減少心肌細(xì)胞凋亡。ZHANG等[7]的研究表明，miR-155可以減少氧化修飾低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成。ZHANG等[8]的研究結(jié)果表明，miR-155可作為改善高糖誘導(dǎo)的心臟纖維化的治療靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步觀(guān)察miR-155在調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用并探究其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而為延緩高血壓病誘導(dǎo)的腎臟纖維化以及尋找新的高血壓腎病治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。定期更換細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器：Ang II購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SC79購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Collagen I、N-cadherin、α-SMA、TGF-β和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK8和RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司；Mastercycler X50熒光定量PCR儀購(gòu)于德國(guó) Eppendorf公司；ChemiDoc XRS+System曝光儀購(gòu) 于美國(guó)Bio-Rad公司；BX63 熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建及細(xì)胞分組：體外培養(yǎng)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔板中。用10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10mol/L濃度的Ang II處理NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞48 h，選取最宜濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang II組、NC miRNA處理 組、miR-155 inhibitor處理組、溶劑對(duì)照組和蛋白激酶B（AKT）激動(dòng)劑處理組。對(duì)照組NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞給予單純更換培養(yǎng)基處理；Ang II組給予10-7mol/L的Ang II處理48 h誘導(dǎo)EMT過(guò)程；NC miRNA處理組和miR-155 inhibitor處理組在給予NC miRNA和miR-155 inhibitor預(yù)處理6 h后予10-7mol/L的Ang II處理48 h。溶劑對(duì)照組在miR-155 inhibitor預(yù)處理6 h后，給予含10-7mol/L的Ang II和4 μL/mL DMSO的完全培養(yǎng)基處理48 h。AKT激動(dòng)劑處理組在miR-155 inhibitor預(yù)處理6 h后，給予含10-7mol/L的Ang II和4 μg/mL AKT激動(dòng)劑SC79的完全培養(yǎng)基處理48 h。

1.2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性：將CCK8染料加入96孔板內(nèi)并孵育3 h，通過(guò)檢測(cè)490 nm處的吸光度來(lái)評(píng)估存活的細(xì)胞數(shù)。共重復(fù)3次，評(píng)估各組細(xì)胞增殖能力。

1.2.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平：給予NRK-52E細(xì)胞不同處理后，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA并測(cè)定濃度及純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟合成cDNA，通過(guò)Eppendorf MAS熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以U6為內(nèi)參照，miR-155的相對(duì)含量以2-ΔΔCt表示，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)：給予NRK-52E細(xì)胞不同處理后，吸去上清液。加入蛋白裂解液，刮取貼壁細(xì)胞并吸入離心管中，離心后取上清液并測(cè)定總蛋白含量，經(jīng)凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3遍后分別加一抗GAPDH（1:5 000）、Collagen I（1:1 000）、 N-cadherin（1:1 000）、α-SMA（1:1 000）、TGF-β（1:1 000）、p-AKT（1:1 000）和AKT（1:1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后用ECL試劑顯影曝光。Collagen I、N-cadherin、α-SMA和TGF-β以GAPDH蛋白條帶作為參照，p-AKT以AKT蛋白條帶作為參照，通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageLab圖像軟件定量分析每個(gè)條帶灰度值。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)Collagen I表達(dá)：給予NRK-52E細(xì)胞不同處理后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，在4 ℃環(huán)境中用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次后，用0.3% TritonX-100溶液破膜15 min。 再用PBS洗滌3次后，用5%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加Collagen I（1:100）一抗稀釋液后4 ℃過(guò)夜。第2天取出孵育盒，用PBS洗滌3次后，給予熒光二抗孵育1 h，再用PBS洗滌3次。最后用DAPI染核10 min 并滴加熒光猝滅劑后熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光染色結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 不同濃度Ang II對(duì)各組NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 不同濃度Ang II對(duì)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.1 Ang II上調(diào)NRK-52E細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，給予NRK-52E細(xì)胞＞10-8mol/L濃度的Ang II處理可以顯著上調(diào)細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，NRK-52E細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。由圖2可知，與對(duì)照組相比，給予NRK-52E細(xì)胞＞10-8mol/L 的Ang II處理可以顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白α-SMA、Collagen I、N-cadherin和TGF-β蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，蛋白表達(dá)水平逐漸增加。以上研究結(jié)果表明給予10-7mol/L Ang II處理時(shí)NRK-52E細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平已顯著上調(diào)，且該刺激濃度較其他刺激濃度更為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此，本課題組通過(guò)給予NRK-52E細(xì)胞10-7mol/L Ang II處理構(gòu)建高血壓腎病細(xì)胞模型。

2.2 Ang II可上調(diào)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，給予NRK-52E細(xì)胞不同濃度的Ang II處理可以顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平 （P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平逐漸增加，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度Ang II對(duì)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平的影響

2.3 下調(diào)miR-155表達(dá)可以抑制NRK-52E細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，Ang II組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達(dá)水平均顯著增加（均P＜0.05）；與Ang II組相比，NC miRNA處理組NRK-52細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ang II組相比，miR-155 inhibitor處理組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 下調(diào)miR-155表達(dá)對(duì)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 下調(diào)miR-155表達(dá)可以抑制NRK-52E細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平 與對(duì)照組相比，Ang II組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）；與Ang II組相比，NC miRNA處理組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Ang II組相比，miR-155 inhibitor處理組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.5 上調(diào)AKT蛋白磷酸化水平可下調(diào)miR-155 inhibitor對(duì)NRK-52E細(xì)胞EMT過(guò)程的抑制作用 與miR-155 inhibitor處理組相比，溶劑對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen I、N-cadherin、AKT蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AKT激動(dòng)劑處理組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Collagen I、Ncadherin蛋白表達(dá)以及AKT蛋白磷酸化水平顯著增加（均P＜0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

圖5 下調(diào)miR-155表達(dá)對(duì)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平的影響

圖6 上調(diào)AKT同時(shí)抑制miR-155表達(dá)對(duì)NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

高血壓是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓增高為主要表現(xiàn)，同時(shí)可伴有心臟、腦和腎臟等全身器官功能性或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[9]。原發(fā)性高血壓患者的體循環(huán)動(dòng)脈血壓增高會(huì)引起腎小管功能損傷，導(dǎo)致腎小管濃縮以及稀釋功能下降，最終導(dǎo)致腎臟功能衰竭。

Ang II為強(qiáng)效血管收縮劑，在高血壓的病理生理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)Ang II與血管緊張素受體結(jié)合后可激活促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)改變，導(dǎo)致上皮細(xì)胞內(nèi)α-SMA、膠原蛋白等表達(dá)增多，進(jìn)而誘導(dǎo)腎臟纖維化[5]。本研究給予NRK-52E細(xì)胞Ang II處理誘導(dǎo)其EMT過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予腎小管上皮細(xì)胞不同濃度的Ang II處理后，細(xì)胞上清液的吸光度值隨著濃度的增加而增加，且細(xì)胞內(nèi)TGF-β、Collagen I、α-SMA、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明Ang II具有促進(jìn)細(xì)胞增殖以及上調(diào)細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的作用。

既往研究表明，TGF-β可通過(guò)調(diào)控miR-155下調(diào)腫瘤蛋白P53誘導(dǎo)性核蛋白1（tumor protein p53-inducible nuclear protein 1，TP53INP1）蛋白表達(dá)水平從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT過(guò)程[10]；TGF-β還可在上調(diào)miR-155表達(dá)的同時(shí)下調(diào)c-Ski蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞EMT過(guò)程[11]；miR-155也可在增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的同時(shí)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT過(guò)程[12]。本研究結(jié)果表明，Ang II可促進(jìn)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平的上調(diào)，且在抑制NRK-52E細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)水平后，Ang II對(duì)細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的促進(jìn)作用受到顯著抑制，提示Ang II可通過(guò)上調(diào)miR-155表達(dá)水平促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生。

AKT是一種在葡萄糖代謝、細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞遷移等過(guò)程中起到重要作用的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶。既往研究表明，AKT通路參與了Ang II誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程[4]，而miR-155可通過(guò)PTEN-PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移能 力[13]。本研究結(jié)果表明，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá) 水平可顯著抑制NRK-52E細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平，且在下調(diào)miR-155表達(dá)的同時(shí)上調(diào)AKT蛋白磷酸化水平，可恢復(fù)miR-155對(duì)細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的上調(diào)作用，提示miR-155可通過(guò)上調(diào)AKT蛋白磷酸化水平誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向著間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。

綜上所述，本研究探討了miR-155在A(yíng)ng II誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中的調(diào)控作用及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-155可通過(guò)調(diào)控AKT信號(hào)通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而誘導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生。