林日丹，夏梁峰，尹會方，費世港，范克偉,，黃思瓊，李曉華,，楊小燕,，戴愛玲,

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖364000；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，龍巖364000）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性高度接觸性B類傳染病。主要引起種豬繁殖障礙；新生仔豬出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀或頑固性腹瀉，死亡率可達90%～100%；育肥豬出現(xiàn)呼吸道或者增重減慢的癥狀等[1]。PRV感染會引起機體免疫抑制，豬體可長期帶毒和排毒，容易并發(fā)感染其他疾病[2]。該病最早發(fā)生于1813年美國1頭表現(xiàn)為極度瘙癢最后死亡的病牛[3]。我國自1947年初次報道偽狂犬病以來，已經(jīng)有31個省市相繼報道，且近年該病在我國的流行呈上升趨勢[4]。福建省于1962年12月長泰縣的黃牛中初次發(fā)現(xiàn)該病，1965年1月在該縣的發(fā)病仔豬中發(fā)現(xiàn)[5]。豬偽狂犬病經(jīng)過疫苗免疫、凈化、撲殺等措施可取得較為明顯的控制效果[6]。自2011年我國華北地區(qū)出現(xiàn)免疫豬場豬偽狂犬病病毒野毒陰性豬群快速感染轉(zhuǎn)陽后，在全國其他多個省份也陸續(xù)發(fā)生該現(xiàn)象[7]。與此同時，2011年從5個省14個暴發(fā)PRV豬場中采集樣本中均分離到了PRV流行毒株且已發(fā)生變異，致病性比以往分離毒株更強[8]。PRV變異毒株的感染和流行給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，其防控與凈化形勢非常嚴峻。

為了掌握2013-2018年福建省西南地區(qū)規(guī)?；i場PRV野毒感染狀況，本實驗室對陸續(xù)收集和采集于該地區(qū)疑似發(fā)病豬群組織樣品及豬血清樣品進行PRV野毒感染病原學(xué)、血清學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 調(diào)查樣品：2013-2018年采自龍巖市的新羅區(qū)、永定縣、武平縣、漳平縣、上杭縣、長汀縣、連城縣及泉州市、漳州市等區(qū)域787個規(guī)?；i場，疑似感染豬偽狂犬病的組織樣品共計1320份，其中包括流產(chǎn)的死胎149份、產(chǎn)房仔豬（0～30日齡）443份、保育豬（30～70日齡）585份、育肥豬（70～180日齡）69份（部分樣品豬群背景信息不詳，未列入統(tǒng)計分析），送檢病例組織樣品的豬場均有免疫PRV-gE基因缺失弱毒疫苗。血清樣品包括種豬46 791份（包括能繁母豬、成年公豬）、后備豬8109份（180日齡以后至配種前）、哺乳小豬2854份（0～30日齡）、保育豬5447份（30～70日齡）、生長育肥豬4459份（70～180日齡），共計3041場次的豬場67 660份血清，送檢血清樣品豬場均有免疫PRV-gE缺失疫苗。

1.2 主要試劑 DL2000 DNA marker、LATaqDNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司；PRV-gE抗體檢測試劑盒（Pseudorabies VirusgE Antibody TestKit）購自北京愛德士生物科技公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)PRV全基因組序列（GenBank登錄號：NC_006151）設(shè)計了針對PRV gE基因的特異性鑒定引物，gE-JD-F：5'-GCGCTG GGCTCCTTCGTGAT-3'，gE-JD-R：5'-CGCCA TAGTTGGGTCCATTCGT-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，擴增片段大小為400 bp。

1.4 病毒DNA的提取 取疑似發(fā)病豬的各組織臟器，根據(jù)MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit說明書提取各組織臟器中的PRV DNA。

1.5 PCR檢測 利用上述鑒定引物擴增PRV gE基因片段。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板2 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，LATaqDNA聚合酶0.25 μL，用ddH2O補至25 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，64℃退火50 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.6 血清抗體檢測 對豬血清樣品嚴格按照PRV gE試劑盒說明書進行PRV ELISA-gE抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 豬組織樣品偽狂犬病病毒野毒感染病原學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1 不同年份豬組織樣品PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果 2013-2018年采集的疑似病例組織樣品的豬偽狂犬病病毒野毒PCR檢測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，陽性豬場占比為52.60%（414/787），核酸陽性率為50.83%（671/1320）。2013-2018年陽性豬場比例在2014年出現(xiàn)明顯上升，由2013年的59.38%上升至79.63%，2014年和2015年陽性豬場比例維持在79.63%和76.97%，2016年后陽性豬場比例開始有所下降，由41.30%下降至27.14%。核酸陽性樣品的變化趨勢與陽性豬場比例一致，分別為55.45%、82.56%、68.03%、37.37%、26.11%、27.32%。2013-2018年采集的疑似病例組織樣品的PRV野毒PCR檢測結(jié)果表明，2014-2015年是福建西南規(guī)模化豬場PRV野毒感染最嚴重時期。

表1 不同年份豬組織樣品PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果Table 1 The detection results of PRV gE PCR in different years

2.1.2 不同年齡段豬組織樣品PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果 對2013-2018年送檢的疑似病例組織樣品按不同年齡段進行分類統(tǒng)計，結(jié)果見表2（部分樣品豬群背景信息不詳，未列入統(tǒng)計分析）。結(jié)果顯示，流產(chǎn)死胎、產(chǎn)房仔豬、保育豬、育肥豬的疑似病例組織樣品檢出PRV野毒核酸陽性率分別為42.28%、46.05%、51.11%、47.83%，且各年份不同年齡段的豬均有感染PRV野毒，其中，2014-2015年不同年齡段豬組織樣品PRV野毒陽性率較高（55.17%～83.18%），2016-2018年不同年齡段豬組織樣品PRV野毒陽性率在18.84%～41.67%。表明2014-2015年福建省西南地區(qū)規(guī)?；i場PR疫情比較嚴重，2016-2018年豬場不同年齡段發(fā)病豬PRV野毒帶毒率仍較高。

表2 不同年齡段豬組織樣品PRV野毒感染PCR檢測結(jié)果Table 2 The detection results of PRV gE PCR in different herds

2.2 豬血清樣品偽狂犬病病毒野毒感染血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 不同年份豬血清樣品PRV野毒感染的血清學(xué)檢測結(jié)果 2013-2018年，送檢的67 660份豬血清樣品PRV野毒抗體（gE抗體）檢測結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，調(diào)查的福建省部分豬場的場陽性率為61.13%，豬血清樣品PRV野毒抗體總陽性率為29.25%。2013-2018年場陽性率分別為47.92%、57.04%、57.98%、64.84%、69.90%、65.84%，血清樣品PRV野毒抗體陽性率分別為18.41%、25.38%、27.47%、31.49%、36.50%、30.13%。2013-2017年P(guān)RV野毒感染的豬場陽性率和血清樣品PRV野毒抗體陽性率呈逐漸上升趨勢，2018年兩項陽性率略低于2017年。

表3 不同年份豬血清樣品PRV野毒感染抗體檢測結(jié)果Table 3 The detection results of PRV gE antibody in different years

2.2.2 不同年齡段豬血清樣品PRV野毒感染的血清學(xué)檢測結(jié)果 不同年齡段豬血清樣品PRV野毒感染抗體檢測結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同年齡段的豬存在一定比例的PRV野毒抗體陽性豬。2013年育肥豬和后備豬血清樣品陽性率較種豬、產(chǎn)房小豬、保育豬高；2014年和2017年種豬和后備豬陽性率高于其他豬群；2015年和2016年后備豬陽性率低于其他豬群，2015年和2018年產(chǎn)房仔豬陽性率高于其他豬群。2014年后不同年齡豬群的PR野毒抗體陽性情況沒有明顯規(guī)律性，可能與豬場自采樣品有關(guān)。

3 討論

自2012年以來，我國多個省份均發(fā)生豬偽狂犬病的流行，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[9-11]。已有研究表明，與以前的流行株相比，新流行PRV毒株的抗原性已發(fā)生變異，現(xiàn)有疫苗不能提供完全保護，同時在全國不同地區(qū)分離出了PRV變異毒株[10-13]。范克偉[14]對2013-2014年閩西地區(qū)15株P(guān)RV流行株的分子遺傳變異特征分析，表明閩西地區(qū)PRV流行株與當(dāng)時國內(nèi)不同省份分離的PRV株處于一個相對獨立的分支中，均為PRV變異株。因此，了解PRV變異株流行后福建省西南地區(qū)PRV野毒感染趨勢，對下一步豬偽狂犬病的防控具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

本研究利用PCR方法，對2013-2018年福建西南地區(qū)787個規(guī)?；i場的疑似PRV感染組織樣品共1320份進行病原學(xué)檢測。結(jié)果表明，組織樣本總陽性率為50.83%，豬場總陽性率為52.60%，其中2014年豬場組織樣品陽性率為82.56%，豬場陽性率為79.63%，均高于其他年份；2015年保持較高水平，分別為68.03%、76.97%；2016-2018年P(guān)RV野毒感染組織樣品及豬場陽性率相較于2013-2015年有所下降。本次調(diào)查結(jié)果顯示，福建西南地區(qū)2013年P(guān)RV野毒組織樣品陽性水平均高于唐佩娟（2013年，天津）[15]報道的16.7%、齊向濤（2013年，新疆）[16]報道的40.2%。PRV總陽性率高于王慧[17]（2013-2017年，湖南）報道的32.8%，但流行趨勢與王慧等[17]和董雅琴等[18]報道的一致，總體呈下降趨勢。

通過對2013-2018年采集的67 660份豬血清樣品進行PRV野毒感染gE抗體檢測，結(jié)果顯示，血清樣本總陽性率為29.25%，豬場總陽性率為61.13%。2014-2018年血清陽性率（25.38%、27.47%、31.49%、36.50%、30.13%）和豬場陽性率（57.04%、57.98%、64.84%、69.90%、65.84%），與2013年的18.41%、47.92%及前期對福建省部分地區(qū)豬偽狂犬野毒感染的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果更高[19]，特別是場陽性率在2016-2018年處于較高水平（60%～70%）。董雅琴等[18]對我國豬群疫病流行情況分析證實，自2013年起豬場血清陽性率顯著上升，2017年全國PR血清陽性率達到36.65%；李海琴等[20]報道江西省部分地區(qū)2016-2017年P(guān)R血清陽性率37.4%和豬場陽性率65.6%，較江西2016年之前的高；解偉濤等[21]報道河南省部分地區(qū)2014-2016年P(guān)R血清陽性率46.2%和豬場陽性率90.0%，王昌建等[22]報道湖南省部分地區(qū)2013年P(guān)R血清陽性率45.5%和豬場陽性率66.4%。調(diào)查結(jié)果表明，自PRV變異毒株流行后，福建省乃至全國PRV野毒感染陽性豬場和血清樣品野毒抗體陽性比例處于較高水平。

從不同年齡段的豬群（包括流產(chǎn)死胎、產(chǎn)房仔豬、保育豬和育肥豬）中分析PRV病原感染情況，不同年齡段的豬群存在一定程度的PRV野毒感染，2014-2015年每個階段豬PRV野毒檢出率均較高，2016-2018年檢出率均略有下降。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果反映，2013年育肥豬和后備豬血清陽性率較種豬、產(chǎn)房小豬、保育豬高；調(diào)查結(jié)果表明，2013年以后育肥階段的豬群已經(jīng)存在野毒感染，但未引起養(yǎng)殖戶的足夠重視，直至2014年和2015年福建西南地區(qū)大范圍發(fā)生豬偽狂犬病的疫情，導(dǎo)致2016-2018年P(guān)RV野毒抗體陽性豬場的場陽性率在60%以上，不同年齡段的豬組織樣品有18.84%～41.67%的PRV野毒核酸陽性檢出率，血清樣品野毒抗體陽性率維持在24.27%～42.83%，表明PR的防控形勢日趨嚴峻。

本研究數(shù)據(jù)全部來自有免疫PRV-gE基因缺失弱毒疫苗的豬場，gE基因缺失疫苗持續(xù)應(yīng)用于豬群的免疫，使得通過實驗室檢測在臨床上區(qū)分疫苗免疫豬與野毒感染豬成為可能。但從本次調(diào)查結(jié)果及我國PR流行現(xiàn)狀分析，我國存在較高比例的PR野毒感染陽性豬場。種豬和后備豬是生豬可持續(xù)生產(chǎn)的源頭，較高比例帶毒種豬和后備豬成為豬場病毒的存儲器。即使通過實驗室可以檢測區(qū)分野毒感染豬，在目前生豬價格居高不下，生豬產(chǎn)能需要繼續(xù)提升的情況下，不可能全部淘汰陽性豬，陽性豬場短時間內(nèi)不可能變成陰性豬場，使得偽狂犬病凈化非常艱巨。本次病原學(xué)檢測表明，產(chǎn)房仔豬和保育豬仍然存在一定比例的PRV野毒感染現(xiàn)象，這兩個階段豬群發(fā)病與母豬帶毒有一定關(guān)系，帶毒母豬在應(yīng)激或其他免疫抑制病影響情況下通過垂直傳播感染仔豬。盡管不少豬場采取商品豬免疫1～2次的免疫程序，但育肥豬的病原學(xué)和血清學(xué)檢測結(jié)果表明，許多豬場育肥豬PRV野毒感染呈活躍狀態(tài)，表明疫苗免疫未有效阻止豬只感染。有研究證明，偽狂犬病病毒抗體在90～120日齡后逐漸消失[23]，免疫過早易出現(xiàn)母源抗體干擾，免疫過遲則出現(xiàn)抗體空白期，導(dǎo)致豬群有暴露感染的風(fēng)險。此外，育肥舍豬群密度大，有些豬場缺乏全進全出的生產(chǎn)管理措施，作為免疫抑制病如豬繁殖與呼吸障礙綜合征和豬圓環(huán)病毒病的易發(fā)階段，育肥豬再次感染偽狂犬病病毒野毒的壓力增大。因此，現(xiàn)階段，除加強生物安全等飼養(yǎng)管理措施外，通過病原學(xué)、血清學(xué)定期監(jiān)測掌握PRV野毒感染動態(tài)，實時制定合理的免疫程序至關(guān)重要。以避免由于受生產(chǎn)不穩(wěn)定、應(yīng)激因子等因素影響，出現(xiàn)偽狂犬病病毒恢復(fù)排毒及臨床發(fā)病癥狀，甚至伴隨出現(xiàn)其他疫病的混合感染使得豬場的疫病控制更加復(fù)雜化的現(xiàn)象。