陳丹清，王 建

（江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，常州 213161）

雞白痢沙門菌（SalmonellaPullorum）為腸桿菌科沙門菌屬成員，是一類在雞場中較為常見的重要病原菌[1-2]，可引起雛雞的下痢、急性敗血癥等，死亡率較高，成年雞則主要呈現(xiàn)慢性感染或隱性感染，可長期帶毒且可經(jīng)卵垂直傳播，給養(yǎng)雞戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。目前使用抗生素進(jìn)行治療仍是防治雞白痢的重要措施之一，但由于抗生素的長期甚至是不合理使用，使得沙門菌產(chǎn)生了廣泛而嚴(yán)重的耐藥[6-9]，因此，加強(qiáng)雞場中病原菌的耐藥性監(jiān)測對于細(xì)菌病的防治至關(guān)重要。

本研究采集某雞場疑似感染雞白痢的病死雞組織，進(jìn)行沙門菌的分離、鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，為該雞場合理用藥提供指導(dǎo)，也為該地區(qū)雞白痢的綜合防控及耐藥性監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 選取某雞場臨床癥狀與病理變化疑似雞白痢的病死雞32只，采集肝臟與心臟等組織作為待檢病料。

1.2 試劑 麥康凱瓊脂、LB培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、吲哚、硫化氫、枸櫞酸鹽）及藥敏紙片（阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢唑林、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素）購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL2000 DNA marker、2×TaqPCR Master Mix購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病死雞的肝臟、心臟等組織樣品接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，選取單個可疑菌落按常規(guī)方法于平板上反復(fù)劃線，挑取典型單克隆菌落置于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用于后續(xù)鑒定。

1.4 分離菌株的染色鏡檢 挑取單克隆菌落制成涂片，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進(jìn)行染色、鏡檢，觀察菌株形態(tài)。

1.5 分離株的生化試驗(yàn) 按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書，將單克隆菌株分別接種至各生化管中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果。

1.6 雞白痢沙門菌的PCR鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，合成雞白痢沙門菌的血清型特異性PCR檢測引物。F：5'-CGATAATGGCAACCGCACTG-3'，R：5'-TGATGTCTGCCCCTTTCGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為356 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

取200 μL待檢菌液采用煮沸裂解法提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR鑒定，同時以滅菌ddH2O為陰性對照。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。根據(jù)1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，判定分離菌株血清型。

1.7 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 以大腸埃希氏菌ATCC25922為藥敏質(zhì)控菌株，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行分離菌株的藥敏試驗(yàn)[11]。將分離菌株24 h培養(yǎng)菌液用無菌生理鹽水配置成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，均勻涂布于LB瓊脂平板上，貼上藥敏紙片置于37℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑，判定分離菌株對10種常用抗生素的耐藥情況[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的初步分離與鏡檢 病死雞組織中分離的可疑菌株在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、光滑、白色或無色的細(xì)小菌落，將菌落反復(fù)純化培養(yǎng)，共獲得27株可疑菌株培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢均為短小、兩頭鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，多為分散存在，符合沙門菌的菌落特征。

2.2 生化試驗(yàn) 將27株純培養(yǎng)的可疑菌株接種至微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)24～48 h后，分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果一致（表1），均能發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、麥芽糖，不產(chǎn)生吲哚、硫化氫，不利用枸櫞酸鹽，符合雞白痢沙門菌的生化特性。

表1 分離菌株的生化特性Table 1 Biochemical characteristics of isolates

2.3 菌株血清型的PCR鑒定 用雞白痢沙門菌特異性引物進(jìn)行PCR檢測，27株可疑菌株均可擴(kuò)增出356 bp的目的條帶（圖1），證明分離所得的菌株均為雞白痢沙門菌。

圖1 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of partial isolates

2.4 藥敏試驗(yàn) 對27株雞白痢沙門菌分離株進(jìn)行了10種常用抗生素的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。分離株除了對阿米卡星和慶大霉素的敏感率達(dá)100%以外，對于其他8種藥物均有不同程度的耐藥情況，耐藥率由高到低分別為：鏈霉素（88.89%）、四環(huán)素（62.96%）、阿莫西林（51.85%）、強(qiáng)力霉素（37.04%）、頭孢唑林（29.63%）、恩諾沙星（14.81%）、環(huán)丙沙星（7.41%）、頭孢噻肟（3.70%）。

表2 雞白痢沙門氏菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The antimicrobial resistance of Salmonella pullorum isolates

沙門菌分離株的多重耐藥情況也十分嚴(yán)重，所有分離菌株至少可耐1種藥物，70.37%（19/27）的菌株可耐3種以上藥物，其中3耐菌株數(shù)量最多，達(dá)48.15%（13/27），而7.41%（2/27）的菌株最多可耐5種藥物（圖2）。這嚴(yán)重的多重耐藥大大增加了疾病防治的難度。

圖2 雞白痢沙門菌分離株的多重耐藥情況Fig.2 Multi-drug resistance of Salmonella Pullorum isolates

根據(jù)本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議該雞場選取阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟等高敏藥物進(jìn)行雞白痢的防治工作，并在治療過程中采用交叉用藥、輪換用藥等方式，以達(dá)到較好的療效，降低耐藥菌株產(chǎn)生的可能性[13]。同時，加強(qiáng)雞場的飼養(yǎng)管理水平，建立生物安全體系，定期對環(huán)境及器械等進(jìn)行消毒，消除致病菌的增殖與傳播，保證雞群的健康。