阿曼古麗·斯拉依,趙衛(wèi)東,王進(jìn)香,趙建國,黃 燕,韓先干,王 旭,龔海燕,米榮升,陳兆國
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(上海)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200241;2.新疆伊犁州動(dòng)物疾病控制與診斷中心,伊寧8350993;3.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,銀川750011;4.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院 教育部熱帶生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,???570228)
隱孢子蟲(Cryptosporidium spp)是一種重要的人獸共患寄生性原蟲,可以通過污染了卵囊的水或食物進(jìn)行傳播,能夠引起人和動(dòng)物腹瀉。隱孢子蟲在全世界范圍內(nèi)均有報(bào)道,各個(gè)年齡階段均可感染,兒童和幼齡動(dòng)物更易感,嚴(yán)重的可以造成死亡[1]。
傳統(tǒng)的隱孢子蟲檢測方法是對糞便樣品進(jìn)行染色或飽和蔗糖漂浮,然后用顯微鏡進(jìn)行鏡檢。但是,很多隱孢子蟲形態(tài)學(xué)非常相似,僅利用常規(guī)的顯微鏡檢技術(shù)無法鑒別蟲種,而使用PCR擴(kuò)增結(jié)合測序方法,能夠鑒定感染的蟲種或基因型[2]。當(dāng)前,應(yīng)用分子檢測方法,已經(jīng)鑒定的隱孢子蟲蟲種多達(dá)30多種。雖然并不是所有蟲種均可以感染人[3],但有必要對動(dòng)物感染的隱孢子蟲進(jìn)行蟲種鑒定,弄清感染的蟲種或基因型,這對于制定有效的防控措施具有重要的意義。
伊犁河谷位于新疆西北部,河谷內(nèi)北、東、南三面環(huán)山,自東向西敞開為“U”形谷地,屬于溫帶大陸性氣候,氣候溫和濕潤,素有“天山濕島”之稱[4]。伊犁河谷區(qū)域包括伊犁州八縣兩市,具有得天獨(dú)厚的草地畜牧業(yè)條件,天然草地面積占河谷土地總面積的60.9%,畜牧業(yè)是伊犁河谷最具優(yōu)勢的產(chǎn)業(yè)之一[5]。養(yǎng)牛業(yè)在伊犁河谷地區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要的位置,而新疆褐牛的養(yǎng)殖量占該地區(qū)牛養(yǎng)殖量的62.9%[6];同時(shí),伊犁河谷也是新疆褐牛最大的養(yǎng)殖基地,養(yǎng)殖量占全疆的60.0%[7]。
新疆褐牛是我國自主培育的耐粗飼、耐嚴(yán)寒、放牧性能優(yōu)越的乳肉兼用品種,是新疆農(nóng)牧區(qū)黃牛改良的主推品種,西北地區(qū)部分省市也有少量引進(jìn)與繁育,具有西北第一牛的美稱[7]。然而,關(guān)于新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況報(bào)道還非常少,2016年,僅見Qi等[8]對新疆5個(gè)地區(qū)少量樣品的檢測,其中包含伊犁河谷區(qū)域昭蘇縣72份成年褐牛樣本的檢測。因此,關(guān)于伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況以及感染的隱孢子蟲蟲種或基因型,是否存在人獸共患蟲種,對養(yǎng)殖業(yè)是否造成影響等問題,均有待研究。為了解伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲病分子流行情況,本研究對伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)褐牛養(yǎng)殖場進(jìn)行糞便樣品采集,進(jìn)行隱孢子檢測,以了解和掌握該地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況,以及感染的蟲種或基因型,為制定有效的隱孢子蟲防控方案提供數(shù)據(jù)支持。
1.1 試驗(yàn)材料 隱孢子蟲DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)與食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存;基因組DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil)購自美國MP公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;pLB零背景快速克隆試劑盒購自天根生化(北京)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、瓊脂糖(Agarose)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA聚合酶(KOD FX)購自東洋紡生物科技有限公司;DL2000 DNA marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。
1.2 樣品采集 選取伊犁河谷區(qū)域內(nèi)伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)養(yǎng)殖場為采樣點(diǎn),分別于2018年12月(冬季)和2019年4月(春季)進(jìn)行糞便樣品采集。每個(gè)養(yǎng)殖場按斷奶前犢牛、斷奶后犢牛、育成牛和成年牛分類進(jìn)行采集,每個(gè)年齡段至少采集10份。所有樣品置于低溫保存盒,帶回實(shí)驗(yàn)室。
1.3 樣品的前處理 樣品加少量PBS溶解,吸管反復(fù)吹打沖洗,棄去棉簽,吸糞水溶液于2 mL無菌離心管中,PBS反復(fù)洗2次后離心,棄上清液,沉淀用于DNA的提取。
1.4 樣品DNA的提取 嚴(yán)格按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒操作說明提取樣品DNA,用100 μL洗脫緩沖液收集樣品DNA,-20℃保存,待檢。
1.5 引物的合成 以隱孢子蟲小亞基核糖體DNA(SSUrDNA)為目的基因,進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的外引物序列為:5'-TTCTAGAGCTAATA CATGCG-3'(P1-1)和5'-CCCATTTCCTTCGAA ACAGGA-3'(P1-2);內(nèi)引物序列為:5'-GGAAG GGTTGTATTTATTAGATAAAG-3'(P2-1)和5'-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3'(P2-2)[9-10]。引物送賽默飛世爾科技(中國)有限公司進(jìn)行合成。
1.6 樣品的PCR擴(kuò)增 每份待檢樣品取2 μL,依據(jù)參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增SSUrDNA。取第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在1.2%的瓊脂凝膠上進(jìn)行電泳,凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。
1.7 陽性樣品的分子鑒定 將經(jīng)電泳鑒定正確的PCR膠回收產(chǎn)物用快速克隆試劑盒與載體進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化,挑取陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)和PCR鑒定,將鑒定正確的陽性克隆送賽默飛世爾科技(中國)有限公司測序。將獲得的序列進(jìn)行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,鑒定所感染的隱孢子蟲蟲種或基因型;同時(shí),應(yīng)用Lasergene 7.0軟件對獲得的序列進(jìn)行同源性分析。
1.8 陽性樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 從GenBank上下載多種隱孢子蟲的SSUrRNA基因序列作為參考序列,以柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的SSUrDNA基因序列(GenBank登錄號(hào):AF026388)作為外源序列。利用MEGA 7.0軟件,與本試驗(yàn)獲得的隱孢子蟲序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)一步確認(rèn)新疆褐牛感染的隱孢子蟲的蟲種或基因型。
1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS V21.0,對不同養(yǎng)殖場、不同日齡和不同季節(jié)之間的感染情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2),比較不同條件下新疆褐牛的感染率是否存在差異。當(dāng)P>0.05時(shí),判定為差異不顯著,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P<0.05時(shí),判定為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 伊犁河谷新疆褐??偟母腥厩闆r 本研究以新疆褐牛為研究對象,從伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)養(yǎng)殖場采集356份糞便樣品進(jìn)行隱孢子蟲檢測。提取所有樣品DNA,進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增,成功擴(kuò)增出12份陽性樣品,PCR擴(kuò)增的目的片段大小為830 bp,與預(yù)期一致(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲總的感染率為3.37%(12/356),高于Qi等[8](2016)對新疆部分地區(qū)褐牛隱孢子蟲感染情況的報(bào)道(2.29%,10/436),也高于作者對伊犁河谷區(qū)域昭蘇縣褐牛所報(bào)道的感染率(2.78%,2/72)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,將本試驗(yàn)獲得的結(jié)果與Qi等[8]報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)兩者差異并不顯著(P>0.05),說明本試驗(yàn)的結(jié)果與之前的報(bào)道基本一致。
圖1 部分新疆褐牛樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification of partial samples collected from Xinjiang Brown cattle
雖然有關(guān)新疆褐牛感染隱孢子蟲的報(bào)道非常少,但是目前我國其他品種的牛感染隱孢子蟲的報(bào)道已經(jīng)非常多,尤其是奶牛和牦牛。對我國30年來牛感染隱孢子蟲情況的調(diào)查研究顯示,我國牛隱孢子蟲總的感染率為14.50%,其中奶牛感染率為13.98%,牦牛為20.92%,肉牛為10.47%,水牛為15.50%[12]。本研究發(fā)現(xiàn)新疆褐牛隱孢子蟲感染率為3.37%,明顯低于我國其他品種牛的感染水平,提示隱孢子蟲的感染可能與牛的品種相關(guān)。
由于新疆褐牛隱孢子蟲的檢出率比較低,本研究取了部分陰性樣品用飽和蔗糖漂浮后進(jìn)行鏡檢驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)鏡檢結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致,均為陰性。同時(shí),對12份陽性樣品進(jìn)行鏡檢,僅發(fā)現(xiàn)5份陽性樣品,這可能與樣品中隱孢子蟲的含量較低有關(guān),因?yàn)镻CR檢測方法與常規(guī)的顯微鏡檢測相比敏感性更高。
2.2 不同地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲感染情況 本次調(diào)查選取伊寧市和察布查爾錫伯自治縣4個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行取樣。其中,伊寧市2個(gè)養(yǎng)殖場共采集樣品195份,感染率為4.10%(8/195),僅在養(yǎng)殖場1發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲陽性樣品,陽性率為8.08%(8/99),養(yǎng)殖場3的陽性率為5.00%(4/80);察布查爾錫伯自治縣2個(gè)養(yǎng)殖場共采集樣品161份,感染率為2.48%(4/161),僅在養(yǎng)殖場3發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染,陽性率為5.00%(4/80)(表1、2)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,兩個(gè)地區(qū)之間感染率差異不顯著(χ2=0.709,P>0.05),但是不同養(yǎng)殖場之間感染率存在顯著性差異(χ2=13.569,p<0.05),而養(yǎng)殖場1/養(yǎng)殖場3與養(yǎng)殖場3/養(yǎng)殖場4之間均存在顯著性差異(P<0.05)。
表1 不同地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 1 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different regions in Xinjiang Brown cattle
表2 不同養(yǎng)殖場新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 2 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different farms in Xinjiang Brown cattle
2.3 不同日齡新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況 本次調(diào)查中每個(gè)養(yǎng)殖場按斷奶前犢牛、斷奶后犢牛、育成牛和成年牛4個(gè)年齡段進(jìn)行取樣。檢測結(jié)果表明,成年牛的感染率最高(5.59%,9/161),其次是育成牛(3.45%,2/58)和斷奶后犢牛(1.12%,1/89),而斷奶前犢牛并未檢出隱孢子蟲感染,但不同日齡間感染率差異并不顯著(χ2=5.490,p>0.05)(表3)。有研究表明,犢牛對隱孢子蟲更易感,隨著牛的日齡增大,隱孢子蟲的感染率會(huì)逐漸下降[13]。然而,本研究結(jié)果與之前關(guān)于其他品種牛的報(bào)道不一致,這可能是由于冬季和春季為產(chǎn)犢淡季,導(dǎo)致本次調(diào)查中造成斷奶前犢牛采樣數(shù)量偏少,因此需要進(jìn)一步采集更多數(shù)量的斷奶前犢牛樣品對本次調(diào)查結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
表3 不同日齡新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 3 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different age groups in Xinjiang Brown cattle
2.4 不同季節(jié)新疆褐牛隱孢子蟲感染情況 本次調(diào)查分別在冬季和春季對新疆褐牛進(jìn)行了采樣。結(jié)果顯示,冬季的感染率為5.68%(10/176),春季的感染率為1.11%(2/180),呈顯著性差異(χ2=5.708,p<0.05)(表4),該結(jié)果不同于其他品種牛的報(bào)道。2013年,Mi等[14]對青海地區(qū)牦牛感染隱孢子蟲的調(diào)查發(fā)現(xiàn),春天的感染率最高(28.35%);2011年,Wang等[15]對河南斷奶前奶牛的調(diào)查發(fā)現(xiàn),夏季的感染率最高(50.00%)。由于本試驗(yàn)只在冬季和春季進(jìn)行了取樣,因此,還不能確定是否冬季感染率最高,需要進(jìn)一步對夏季和秋季進(jìn)行取樣檢測加以驗(yàn)證。
表4 不同季節(jié)新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 4 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different seasons in Xinjiang Brown cattle
2.5 新疆褐牛陽性樣品的序列分析結(jié)果 將12份陽性樣品進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序,將獲得的陽性克隆序列進(jìn)行Blast比對以鑒定蟲種或基因型,同時(shí)利用Lasergene 7.0軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),伊犁河谷新疆褐牛存在2種隱孢子蟲感染,為安氏隱孢子蟲(C. andersoni)和瑞氏隱孢子蟲(C. ryanae),其中91.67%(11/12)是C. andersoni感染,僅發(fā)現(xiàn)1份C. ryanae感染(表1)。其中,10個(gè)C. andersoni陽性樣品(CB-8、CB-36、YN-1、YN-2、YN-3、YN-10、YN-11、YN-25、YN-26、YN-62)與KF271456同源性為100%,1個(gè)C.andersoni陽性樣品(CB-25)與KF826311同源性為100%,1個(gè)C. ryanae陽性樣品(CB-26)與KT922233同源性為100%(圖2)。應(yīng)用MEGA 7.0軟件對本研究獲得的12條SSUrDNA序列及GenBank上下載的不同種隱孢子蟲序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)與Blast比對的結(jié)果一致,所有陽性樣品均與相對應(yīng)的C. andersoni和C. ryanae序列在同一個(gè)分支上(圖3)。
圖3 隱孢子蟲的 SSUrDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建Fig. 3 Phylogenetic tree of SSUrDNA sequences of Cryptosporidium spp.
圖2 本研究獲得的隱孢子蟲序列同源性比較Fig. 2 Homology comparison of different sequences of positive samples from Xinjiang Brown cattle
從不同地區(qū)、不同日齡和不同季節(jié)來看,新疆褐牛感染的蟲種均存在差異。其中,伊寧市僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染,察布查爾錫伯自治縣發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染,但是C. andersoni是優(yōu)勢種(75.00%,3/4)(表1、2);斷奶后犢牛和育成牛中僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染,而成年牛則發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染,但C. andersoni是優(yōu)勢種(88.89%,8/9)(表3);春季僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染,而冬季則發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染(表4)。
對我國牛感染隱孢子蟲的蟲種進(jìn)行總結(jié)發(fā)現(xiàn),我國奶牛和肉牛中感染率最高的蟲種是C. andersoni,牦牛中感染率最高的是C. bovis,水牛中感染率最高的是C. ryanae[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)C. andersoni為褐牛感染的優(yōu)勢蟲種,占陽性樣品的91.67%。新疆褐牛屬于肉牛的一個(gè)品種,本研究檢測結(jié)果與之前的報(bào)道一致[12-13]。與本研究不同的是,2016年,Qi等[8]對新疆褐牛成年牛進(jìn)行蟲種鑒定,僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染。然而,2015年,Qi等[16]對新疆地區(qū)奶牛隱孢子蟲的檢測發(fā)現(xiàn)4種隱孢子蟲,包括牛隱孢子蟲(C. bovis)、微小隱孢子蟲(C. parvum)、瑞氏隱孢子蟲(C. ryanae)和安氏隱孢子蟲(C. andersoni),其中C. parvum在斷奶前犢牛中感染率最高(59.5%),而C. andersoni在成年牛中感染率最高(51.1%)。這些結(jié)果的差異可能與牛的品種、采樣地區(qū)的不同有關(guān)。
人和動(dòng)物主要通過糞口途徑感染隱孢子蟲,尤其是污染了卵囊的食物和水進(jìn)行傳播,其中以介水傳播最為嚴(yán)重,容易引起大規(guī)模的暴發(fā)流行[17]。伊犁河谷區(qū)域有新疆徑流量最豐富的伊犁河,是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的主要用水來源。2009年,孟靜等[18]在伊寧市采集伊犁河水樣20 L,樣品經(jīng)過濾濃縮以后,應(yīng)用飽和蔗糖漂浮法和免疫磁珠分離法(immunomagnetic separation,IMS)進(jìn)行檢測,隱孢子蟲均為陽性。隨后,作者用PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性,restriction fragment length polymorphism)技術(shù)進(jìn)行蟲種鑒定,樣品經(jīng)SspI和VspI酶切后電泳分析,初步鑒定為小鼠隱孢子蟲,但是并未對樣品進(jìn)行測序[19]。然而,利用生物信息學(xué)方法對本研究獲得的C. andersoni序列進(jìn)行SspI和VspI酶切分析,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物片段大?。⊿spI:448 bp、397 bp;VspI:730 bp、115 bp)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的電泳條帶大小相似,推測該伊犁河水感染的隱孢子蟲應(yīng)為C. andersoni,這與本研究在養(yǎng)殖場檢測的蟲種相同。我國其他地方也有關(guān)于水中檢出C. andersoni的報(bào)道。2011年,F(xiàn)eng等[20]對上海水源隱孢子蟲檢測,發(fā)現(xiàn)C. andersoni的檢出率高達(dá)82.35%(14/17);2019年,Ma等[21]對西寧水源隱孢子蟲的檢測,也發(fā)現(xiàn)C. andersoni陽性樣品。因此,新疆褐牛感染的隱孢子蟲可能來源于水源污染,但這需要對牧場及其周圍的水進(jìn)行進(jìn)一步檢測才能確認(rèn)。
綜上所述,本研究從不同地區(qū)、不同日齡和不同季節(jié)角度,首次系統(tǒng)地調(diào)查了伊犁河谷地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況。研究發(fā)現(xiàn),采自伊犁河谷區(qū)域4個(gè)新疆褐牛養(yǎng)殖場的樣品,2個(gè)養(yǎng)殖場樣品中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染,總感染率為3.37%,該結(jié)果顯著低于我國其他品種牛隱孢子蟲的平均感染水平。本調(diào)查結(jié)果中,成年褐牛的感染率最高,但是與其他日齡之間差異不顯著;而冬季的感染率則顯著高于春季。分子鑒定結(jié)果表明,該地區(qū)新疆褐牛存在C. andersoni和C. ryanae兩種隱孢子蟲感染,其中C. andersoni是優(yōu)勢種(91.67%)。雖然C. andersoni有感染人的報(bào)道[22-24],目前并不是感染人的優(yōu)勢種,但仍需引起注意,尤其是牧區(qū)的牧民。本研究結(jié)果為深入了解伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲的流行情況和制定有效的防控措施提供數(shù)據(jù)支持。