阿曼古麗·斯拉依，趙衛(wèi)東，王進(jìn)香，趙建國，黃 燕，韓先干，王 旭，龔海燕，米榮升，陳兆國

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.新疆伊犁州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，伊寧8350993；3.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，銀川750011；4.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院 教育部熱帶生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

隱孢子蟲（Cryptosporidium spp）是一種重要的人獸共患寄生性原蟲，可以通過污染了卵囊的水或食物進(jìn)行傳播，能夠引起人和動(dòng)物腹瀉。隱孢子蟲在全世界范圍內(nèi)均有報(bào)道，各個(gè)年齡階段均可感染，兒童和幼齡動(dòng)物更易感，嚴(yán)重的可以造成死亡[1]。

傳統(tǒng)的隱孢子蟲檢測方法是對糞便樣品進(jìn)行染色或飽和蔗糖漂浮，然后用顯微鏡進(jìn)行鏡檢。但是，很多隱孢子蟲形態(tài)學(xué)非常相似，僅利用常規(guī)的顯微鏡檢技術(shù)無法鑒別蟲種，而使用PCR擴(kuò)增結(jié)合測序方法，能夠鑒定感染的蟲種或基因型[2]。當(dāng)前，應(yīng)用分子檢測方法，已經(jīng)鑒定的隱孢子蟲蟲種多達(dá)30多種。雖然并不是所有蟲種均可以感染人[3]，但有必要對動(dòng)物感染的隱孢子蟲進(jìn)行蟲種鑒定，弄清感染的蟲種或基因型，這對于制定有效的防控措施具有重要的意義。

伊犁河谷位于新疆西北部，河谷內(nèi)北、東、南三面環(huán)山，自東向西敞開為“U”形谷地，屬于溫帶大陸性氣候，氣候溫和濕潤，素有“天山濕島”之稱[4]。伊犁河谷區(qū)域包括伊犁州八縣兩市，具有得天獨(dú)厚的草地畜牧業(yè)條件，天然草地面積占河谷土地總面積的60.9%，畜牧業(yè)是伊犁河谷最具優(yōu)勢的產(chǎn)業(yè)之一[5]。養(yǎng)牛業(yè)在伊犁河谷地區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要的位置，而新疆褐牛的養(yǎng)殖量占該地區(qū)牛養(yǎng)殖量的62.9%[6]；同時(shí)，伊犁河谷也是新疆褐牛最大的養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖量占全疆的60.0%[7]。

新疆褐牛是我國自主培育的耐粗飼、耐嚴(yán)寒、放牧性能優(yōu)越的乳肉兼用品種，是新疆農(nóng)牧區(qū)黃牛改良的主推品種，西北地區(qū)部分省市也有少量引進(jìn)與繁育，具有西北第一牛的美稱[7]。然而，關(guān)于新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況報(bào)道還非常少，2016年，僅見Qi等[8]對新疆5個(gè)地區(qū)少量樣品的檢測，其中包含伊犁河谷區(qū)域昭蘇縣72份成年褐牛樣本的檢測。因此，關(guān)于伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況以及感染的隱孢子蟲蟲種或基因型，是否存在人獸共患蟲種，對養(yǎng)殖業(yè)是否造成影響等問題，均有待研究。為了解伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲病分子流行情況，本研究對伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)褐牛養(yǎng)殖場進(jìn)行糞便樣品采集，進(jìn)行隱孢子檢測，以了解和掌握該地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況，以及感染的蟲種或基因型，為制定有效的隱孢子蟲防控方案提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 隱孢子蟲DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)與食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）購自美國MP公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；pLB零背景快速克隆試劑盒購自天根生化（北京）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、瓊脂糖（Agarose）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA聚合酶（KOD FX）購自東洋紡生物科技有限公司；DL2000 DNA marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 選取伊犁河谷區(qū)域內(nèi)伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)養(yǎng)殖場為采樣點(diǎn)，分別于2018年12月（冬季）和2019年4月（春季）進(jìn)行糞便樣品采集。每個(gè)養(yǎng)殖場按斷奶前犢牛、斷奶后犢牛、育成牛和成年牛分類進(jìn)行采集，每個(gè)年齡段至少采集10份。所有樣品置于低溫保存盒，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 樣品的前處理 樣品加少量PBS溶解，吸管反復(fù)吹打沖洗，棄去棉簽，吸糞水溶液于2 mL無菌離心管中，PBS反復(fù)洗2次后離心，棄上清液，沉淀用于DNA的提取。

1.4 樣品DNA的提取 嚴(yán)格按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒操作說明提取樣品DNA，用100 μL洗脫緩沖液收集樣品DNA，-20℃保存，待檢。

1.5 引物的合成 以隱孢子蟲小亞基核糖體DNA（SSUrDNA）為目的基因，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的外引物序列為：5'-TTCTAGAGCTAATA CATGCG-3'（P1-1）和5'-CCCATTTCCTTCGAA ACAGGA-3'（P1-2）；內(nèi)引物序列為：5'-GGAAG GGTTGTATTTATTAGATAAAG-3'（P2-1）和5'-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3'（P2-2）[9-10]。引物送賽默飛世爾科技（中國）有限公司進(jìn)行合成。

1.6 樣品的PCR擴(kuò)增 每份待檢樣品取2 μL，依據(jù)參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行PCR擴(kuò)增SSUrDNA。取第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在1.2%的瓊脂凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 陽性樣品的分子鑒定 將經(jīng)電泳鑒定正確的PCR膠回收產(chǎn)物用快速克隆試劑盒與載體進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化，挑取陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)和PCR鑒定，將鑒定正確的陽性克隆送賽默飛世爾科技（中國）有限公司測序。將獲得的序列進(jìn)行Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，鑒定所感染的隱孢子蟲蟲種或基因型；同時(shí)，應(yīng)用Lasergene 7.0軟件對獲得的序列進(jìn)行同源性分析。

1.8 陽性樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 從GenBank上下載多種隱孢子蟲的SSUrRNA基因序列作為參考序列，以柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）的SSUrDNA基因序列（GenBank登錄號(hào)：AF026388）作為外源序列。利用MEGA 7.0軟件，與本試驗(yàn)獲得的隱孢子蟲序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步確認(rèn)新疆褐牛感染的隱孢子蟲的蟲種或基因型。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS V21.0，對不同養(yǎng)殖場、不同日齡和不同季節(jié)之間的感染情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（χ2），比較不同條件下新疆褐牛的感染率是否存在差異。當(dāng)P＞0.05時(shí)，判定為差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P＜0.05時(shí)，判定為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 伊犁河谷新疆褐?？偟母腥厩闆r 本研究以新疆褐牛為研究對象，從伊寧市和察布查爾錫伯自治縣的4個(gè)養(yǎng)殖場采集356份糞便樣品進(jìn)行隱孢子蟲檢測。提取所有樣品DNA，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出12份陽性樣品，PCR擴(kuò)增的目的片段大小為830 bp，與預(yù)期一致（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲總的感染率為3.37%（12/356），高于Qi等[8]（2016）對新疆部分地區(qū)褐牛隱孢子蟲感染情況的報(bào)道（2.29%，10/436），也高于作者對伊犁河谷區(qū)域昭蘇縣褐牛所報(bào)道的感染率（2.78%，2/72）。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，將本試驗(yàn)獲得的結(jié)果與Qi等[8]報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩者差異并不顯著（P＞0.05），說明本試驗(yàn)的結(jié)果與之前的報(bào)道基本一致。

圖1 部分新疆褐牛樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification of partial samples collected from Xinjiang Brown cattle

雖然有關(guān)新疆褐牛感染隱孢子蟲的報(bào)道非常少，但是目前我國其他品種的牛感染隱孢子蟲的報(bào)道已經(jīng)非常多，尤其是奶牛和牦牛。對我國30年來牛感染隱孢子蟲情況的調(diào)查研究顯示，我國牛隱孢子蟲總的感染率為14.50%，其中奶牛感染率為13.98%，牦牛為20.92%，肉牛為10.47%，水牛為15.50%[12]。本研究發(fā)現(xiàn)新疆褐牛隱孢子蟲感染率為3.37%，明顯低于我國其他品種牛的感染水平，提示隱孢子蟲的感染可能與牛的品種相關(guān)。

由于新疆褐牛隱孢子蟲的檢出率比較低，本研究取了部分陰性樣品用飽和蔗糖漂浮后進(jìn)行鏡檢驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)鏡檢結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，均為陰性。同時(shí)，對12份陽性樣品進(jìn)行鏡檢，僅發(fā)現(xiàn)5份陽性樣品，這可能與樣品中隱孢子蟲的含量較低有關(guān)，因?yàn)镻CR檢測方法與常規(guī)的顯微鏡檢測相比敏感性更高。

2.2 不同地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲感染情況 本次調(diào)查選取伊寧市和察布查爾錫伯自治縣4個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行取樣。其中，伊寧市2個(gè)養(yǎng)殖場共采集樣品195份，感染率為4.10%（8/195），僅在養(yǎng)殖場1發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲陽性樣品，陽性率為8.08%（8/99），養(yǎng)殖場3的陽性率為5.00%（4/80）；察布查爾錫伯自治縣2個(gè)養(yǎng)殖場共采集樣品161份，感染率為2.48%（4/161），僅在養(yǎng)殖場3發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染，陽性率為5.00%（4/80）（表1、2）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，兩個(gè)地區(qū)之間感染率差異不顯著（χ2=0.709，P＞0.05），但是不同養(yǎng)殖場之間感染率存在顯著性差異（χ2=13.569，p＜0.05），而養(yǎng)殖場1/養(yǎng)殖場3與養(yǎng)殖場3/養(yǎng)殖場4之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

表1 不同地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 1 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different regions in Xinjiang Brown cattle

表2 不同養(yǎng)殖場新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 2 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different farms in Xinjiang Brown cattle

2.3 不同日齡新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況 本次調(diào)查中每個(gè)養(yǎng)殖場按斷奶前犢牛、斷奶后犢牛、育成牛和成年牛4個(gè)年齡段進(jìn)行取樣。檢測結(jié)果表明，成年牛的感染率最高（5.59%，9/161），其次是育成牛（3.45%，2/58）和斷奶后犢牛（1.12%，1/89），而斷奶前犢牛并未檢出隱孢子蟲感染，但不同日齡間感染率差異并不顯著（χ2=5.490，p＞0.05）（表3）。有研究表明，犢牛對隱孢子蟲更易感，隨著牛的日齡增大，隱孢子蟲的感染率會(huì)逐漸下降[13]。然而，本研究結(jié)果與之前關(guān)于其他品種牛的報(bào)道不一致，這可能是由于冬季和春季為產(chǎn)犢淡季，導(dǎo)致本次調(diào)查中造成斷奶前犢牛采樣數(shù)量偏少，因此需要進(jìn)一步采集更多數(shù)量的斷奶前犢牛樣品對本次調(diào)查結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

表3 不同日齡新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 3 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different age groups in Xinjiang Brown cattle

2.4 不同季節(jié)新疆褐牛隱孢子蟲感染情況 本次調(diào)查分別在冬季和春季對新疆褐牛進(jìn)行了采樣。結(jié)果顯示，冬季的感染率為5.68%（10/176），春季的感染率為1.11%（2/180），呈顯著性差異（χ2=5.708，p＜0.05）（表4），該結(jié)果不同于其他品種牛的報(bào)道。2013年，Mi等[14]對青海地區(qū)牦牛感染隱孢子蟲的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，春天的感染率最高（28.35%）；2011年，Wang等[15]對河南斷奶前奶牛的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，夏季的感染率最高（50.00%）。由于本試驗(yàn)只在冬季和春季進(jìn)行了取樣，因此，還不能確定是否冬季感染率最高，需要進(jìn)一步對夏季和秋季進(jìn)行取樣檢測加以驗(yàn)證。

表4 不同季節(jié)新疆褐牛隱孢子蟲分子流行情況Table 4 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different seasons in Xinjiang Brown cattle

2.5 新疆褐牛陽性樣品的序列分析結(jié)果 將12份陽性樣品進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序，將獲得的陽性克隆序列進(jìn)行Blast比對以鑒定蟲種或基因型，同時(shí)利用Lasergene 7.0軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊犁河谷新疆褐牛存在2種隱孢子蟲感染，為安氏隱孢子蟲（C. andersoni）和瑞氏隱孢子蟲（C. ryanae），其中91.67%（11/12）是C. andersoni感染，僅發(fā)現(xiàn)1份C. ryanae感染（表1）。其中，10個(gè)C. andersoni陽性樣品（CB-8、CB-36、YN-1、YN-2、YN-3、YN-10、YN-11、YN-25、YN-26、YN-62）與KF271456同源性為100%，1個(gè)C.andersoni陽性樣品（CB-25）與KF826311同源性為100%，1個(gè)C. ryanae陽性樣品（CB-26）與KT922233同源性為100%（圖2）。應(yīng)用MEGA 7.0軟件對本研究獲得的12條SSUrDNA序列及GenBank上下載的不同種隱孢子蟲序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)與Blast比對的結(jié)果一致，所有陽性樣品均與相對應(yīng)的C. andersoni和C. ryanae序列在同一個(gè)分支上（圖3）。

圖3 隱孢子蟲的 SSUrDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建Fig. 3 Phylogenetic tree of SSUrDNA sequences of Cryptosporidium spp.

圖2 本研究獲得的隱孢子蟲序列同源性比較Fig. 2 Homology comparison of different sequences of positive samples from Xinjiang Brown cattle

從不同地區(qū)、不同日齡和不同季節(jié)來看，新疆褐牛感染的蟲種均存在差異。其中，伊寧市僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染，察布查爾錫伯自治縣發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染，但是C. andersoni是優(yōu)勢種（75.00%，3/4）（表1、2）；斷奶后犢牛和育成牛中僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染，而成年牛則發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染，但C. andersoni是優(yōu)勢種（88.89%，8/9）（表3）；春季僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染，而冬季則發(fā)現(xiàn)C. andersoni和C. ryanae感染（表4）。

對我國牛感染隱孢子蟲的蟲種進(jìn)行總結(jié)發(fā)現(xiàn)，我國奶牛和肉牛中感染率最高的蟲種是C. andersoni，牦牛中感染率最高的是C. bovis，水牛中感染率最高的是C. ryanae[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)C. andersoni為褐牛感染的優(yōu)勢蟲種，占陽性樣品的91.67%。新疆褐牛屬于肉牛的一個(gè)品種，本研究檢測結(jié)果與之前的報(bào)道一致[12-13]。與本研究不同的是，2016年，Qi等[8]對新疆褐牛成年牛進(jìn)行蟲種鑒定，僅發(fā)現(xiàn)C. andersoni感染。然而，2015年，Qi等[16]對新疆地區(qū)奶牛隱孢子蟲的檢測發(fā)現(xiàn)4種隱孢子蟲，包括牛隱孢子蟲（C. bovis）、微小隱孢子蟲（C. parvum）、瑞氏隱孢子蟲（C. ryanae）和安氏隱孢子蟲（C. andersoni），其中C. parvum在斷奶前犢牛中感染率最高（59.5%），而C. andersoni在成年牛中感染率最高（51.1%）。這些結(jié)果的差異可能與牛的品種、采樣地區(qū)的不同有關(guān)。

人和動(dòng)物主要通過糞口途徑感染隱孢子蟲，尤其是污染了卵囊的食物和水進(jìn)行傳播，其中以介水傳播最為嚴(yán)重，容易引起大規(guī)模的暴發(fā)流行[17]。伊犁河谷區(qū)域有新疆徑流量最豐富的伊犁河，是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的主要用水來源。2009年，孟靜等[18]在伊寧市采集伊犁河水樣20 L，樣品經(jīng)過濾濃縮以后，應(yīng)用飽和蔗糖漂浮法和免疫磁珠分離法（immunomagnetic separation，IMS）進(jìn)行檢測，隱孢子蟲均為陽性。隨后，作者用PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性，restriction fragment length polymorphism）技術(shù)進(jìn)行蟲種鑒定，樣品經(jīng)SspI和VspI酶切后電泳分析，初步鑒定為小鼠隱孢子蟲，但是并未對樣品進(jìn)行測序[19]。然而，利用生物信息學(xué)方法對本研究獲得的C. andersoni序列進(jìn)行SspI和VspI酶切分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物片段大?。⊿spI：448 bp、397 bp；VspI：730 bp、115 bp）與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的電泳條帶大小相似，推測該伊犁河水感染的隱孢子蟲應(yīng)為C. andersoni，這與本研究在養(yǎng)殖場檢測的蟲種相同。我國其他地方也有關(guān)于水中檢出C. andersoni的報(bào)道。2011年，F(xiàn)eng等[20]對上海水源隱孢子蟲檢測，發(fā)現(xiàn)C. andersoni的檢出率高達(dá)82.35%（14/17）；2019年，Ma等[21]對西寧水源隱孢子蟲的檢測，也發(fā)現(xiàn)C. andersoni陽性樣品。因此，新疆褐牛感染的隱孢子蟲可能來源于水源污染，但這需要對牧場及其周圍的水進(jìn)行進(jìn)一步檢測才能確認(rèn)。

綜上所述，本研究從不同地區(qū)、不同日齡和不同季節(jié)角度，首次系統(tǒng)地調(diào)查了伊犁河谷地區(qū)新疆褐牛隱孢子蟲的感染情況。研究發(fā)現(xiàn)，采自伊犁河谷區(qū)域4個(gè)新疆褐牛養(yǎng)殖場的樣品，2個(gè)養(yǎng)殖場樣品中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染，總感染率為3.37%，該結(jié)果顯著低于我國其他品種牛隱孢子蟲的平均感染水平。本調(diào)查結(jié)果中，成年褐牛的感染率最高，但是與其他日齡之間差異不顯著；而冬季的感染率則顯著高于春季。分子鑒定結(jié)果表明，該地區(qū)新疆褐牛存在C. andersoni和C. ryanae兩種隱孢子蟲感染，其中C. andersoni是優(yōu)勢種（91.67%）。雖然C. andersoni有感染人的報(bào)道[22-24]，目前并不是感染人的優(yōu)勢種，但仍需引起注意，尤其是牧區(qū)的牧民。本研究結(jié)果為深入了解伊犁河谷區(qū)域新疆褐牛隱孢子蟲的流行情況和制定有效的防控措施提供數(shù)據(jù)支持。