吳康樂，曹 欣，謝 展，肖潤(rùn)林，張志飛

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 湖南 長(zhǎng)沙 410125）

綠狐尾藻（Myriophyllum elatinoides)是小二仙草科狐尾藻屬多年生沉水或浮水草本植物。綠狐尾藻適應(yīng)性強(qiáng)、生物產(chǎn)量大，年產(chǎn)鮮草600～900 t·hm-2，是畜禽污水治理中較好的生物資源[1]。綠狐尾藻莖葉脆嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2]，但綠狐尾藻飼料化利用受到含水量較高（90%左右)的制約。相較于曬（烘)制干草，綠狐尾藻與稻（Oryza sativa)秸、精料等干物質(zhì)含量高的輔料混合青貯加工成青貯飼料更加適合。采用干物質(zhì)含量高的玉米（Zea mays)粉或秸稈等與高水分新料混合青貯，可平衡青貯發(fā)酵時(shí)乳酸菌對(duì)水分的需求。玉米粉富含碳水化合物，常被用作與苜蓿（Medicago sativa)[3]、麻葉蕁麻（Urtica cannabina)[4]等青綠飼草或馬鈴薯（Solanum tuberosum)淀粉渣[5]等生物資源的輔料進(jìn)行混合青貯，可達(dá)到較好的發(fā)酵效果。水稻秸稈在我國(guó)產(chǎn)量大，易收集，價(jià)格低，在高水分青綠飼草混合青貯中添加可有效降低含水量[6]，但水稻秸稈的纖維含量較高，混合青貯會(huì)增加纖維含量。而纖維素酶可分解纖維素，木聚糖酶可降解半纖維素中的阿拉伯木聚糖，二者均能將植物細(xì)胞壁成分降解為可溶性糖，為乳酸菌發(fā)酵提供碳源，有效改善發(fā)酵品質(zhì)，是常用的青貯促進(jìn)劑[7-8]。

前期預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精細(xì)粉碎后的稻秸粉較粉碎的稻秸吸水性更好，且更利于與綠狐尾藻均勻混合；質(zhì)量比70% ∶ 15% ∶ 15%的綠狐尾藻、稻秸粉和玉米粉混合后可基本滿足適宜青貯的含水量（65% ±5%)要求。本研究以此混合比例的青貯原料為研究對(duì)象，分別添加纖維素酶、木聚糖酶以及復(fù)合纖維素酶，旨在探究3 種酶制劑對(duì)綠狐尾藻混合青貯的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響，篩選適宜青貯添加劑，為綠狐尾藻飼料化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站（28°55′36″ N，113°34′65″ E)三級(jí)綠狐尾藻表面流人工濕地的第三級(jí)濕地人工采集自然株高50 cm 左右的綠狐尾藻，粉碎至2～3 cm；稻秸粉和玉米粉為精細(xì)粉碎至1 mm 粉末?；旌锨噘A原料為新鮮綠狐尾藻 + 稻秸粉 + 玉米粉，質(zhì)量比為70% ∶ 15% ∶ 15%。青貯原料的化學(xué)成分如表1 所列。

表1 青貯原料化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of ensilage materials

纖維素酶（50 000 U·g-1)和木聚糖酶（100 000 U·g-1)來源于羅恩試劑有限公司，復(fù)合纖維素酶（纖維素酶20 000 U·g-1+ 木聚糖酶15 000 U·g-1)來源于廣州溢多利有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共4 個(gè)處理，處理1 （C1)為添加纖維素酶0.5 g·kg-1，處理2 （C2)為添加木聚糖酶0.25 g·kg-1，處理3 （C3)為添加復(fù)合纖維素酶0.71 g·kg-1，以上3 種酶分別溶解至10 mL 水中備用，處理4 為對(duì)照組（CK)添加10 mL 等量水。以上添加比例均以混合原料鮮重為基礎(chǔ)計(jì)算。

首先在稻秸粉上分別均勻噴灑各處理組的酶制劑，對(duì)照噴灑等量水，再與一定比例的綠狐尾藻、玉米粉均勻混合。用聚乙烯袋（長(zhǎng)40 cm，寬28 cm，厚度0.02 mm)抽真空保存，每袋500 g 左右，每處理5 次重復(fù)。避光常溫保存30 d 后開包測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

開包后依據(jù)德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)（DLG)評(píng)分法[9]對(duì)混合青貯飼料的嗅覺、結(jié)構(gòu)、色澤3 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，最后計(jì)算總分評(píng)價(jià)等級(jí)。

隨后每處理隨機(jī)取20 g 青貯鮮料，加180 mL去離子水，榨汁機(jī)（九陽JYL-C012 型多功能攪拌機(jī))粉碎，4 層紗布過濾后得到青貯飼料浸提液，每處理3 次重復(fù)。浸提液用于測(cè)定pH、氨態(tài)氮（NH3-N)[10]、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸含量，3 次重復(fù)。乳酸（lactic acid，LA)含量使用高效液相色譜儀（Agilent 1 260)測(cè)定（色譜柱：AcclaimTMOrganic acid （4.00 mm × 150 mm，5 μm)；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：50 mmol·L-1磷酸二氫鈉溶液，運(yùn)行時(shí)間：10 min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm)；乙酸（acetic acid，AA)、丙酸（propionic acid，PA)和丁 酸（butyric acid，BA)含量使用氣相色譜儀（Agilent 7 890A)測(cè)定（色譜 柱：DB-FFAP （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流 速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：50 ∶ 1；程序升溫條件：60 ℃，保持2 min，以20 ℃升至220 ℃，保持3.5 min；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器，溫度：250 ℃)。

另取150 g 青貯飼料，105 ℃殺青15 min 后，65 ℃烘干至恒重，用于測(cè)定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP)、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC)等指標(biāo)[11]，3 次重復(fù)。

依據(jù)日本草地畜產(chǎn)協(xié)會(huì)制定的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)V-Score 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]，計(jì)算V-Score 值，80 分以上良好，60～80 分尚可，60 分以下不良。

1.4 青貯飼料有氧穩(wěn)定性分析

開包后取200 g 青貯料于敞口發(fā)芽盒（12 cm ×12 cm)中室溫下存放，表面蓋上濕紗布，防止交叉污染和減少水分損失。發(fā)芽盒中心插入電子溫度計(jì)至青貯料中2～3 cm，每隔2 h 自動(dòng)記錄一次溫度，飼料核心溫度比外界溫度高出2 ℃時(shí)結(jié)束試驗(yàn)[13]。3 次重復(fù)。以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05 對(duì)不同處理組青貯飼料的部分發(fā)酵指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)等進(jìn)行單因素LSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合青貯飼料的感官評(píng)價(jià)

從氣味、結(jié)構(gòu)與色澤等方面評(píng)價(jià)各酶制劑處理組的感官質(zhì)量（表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)處理組評(píng)價(jià)均達(dá)到優(yōu)等，總分最高的為C2和C3（19 分)，有芳香果味或明顯的面包香味；C1和CK 為16 分，有微弱的丁酸臭味，芳香味弱。4 組的莖葉結(jié)構(gòu)均保持良好。C1、CK 的色澤與原料相似，呈淡褐色；C2、C3的色澤略有變色，呈淡黃色或帶褐色。

表2 酶制劑對(duì)混合青貯飼料感官質(zhì)量的影響Table 2 Effect of enzyme preparation on sensory evaluation of mixed silage

2.2 混合青貯飼料的發(fā)酵指標(biāo)

C3的乳酸含量最高，為4.53%，顯著高于C1和CK （P＜ 0.05)，C1和C2無顯著差異（P ＞0.05)；C2的乙酸含量顯著高于C1和CK （P＜ 0.05)；各處理均未檢測(cè)到丙酸；C3未檢測(cè)到丁酸，其他3 組的丁酸含量也較低，無顯著差異（P＞ 0.05)；各組的V-Score 評(píng)分都在96 分以上，符合優(yōu)質(zhì)青貯評(píng)分范疇。C1、C2和C3的氨態(tài)氮/總氮無顯著差異（P＞ 0.05)，但均顯著低于CK （P＜ 0.05) （表3)。

C3的pH 顯 著 低 于C1、C2和CK，其 中CK 的pH 顯著高于其他處理組（P＜ 0.05)；添加劑處理組的pH 均較低，符合優(yōu)質(zhì)青貯pH 范疇（表3)。各處理組原料含水量在71.82%～73.73%，處理組間沒有顯著差異（P＞ 0.05)，原料含水量略高于常規(guī)青貯適宜含水量（60%～70%) （表3)。

表3 酶制劑對(duì)混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effect of enzyme preparation on fermentation quality of mixed silage

2.3 混合青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)及有氧穩(wěn)定性

C1的CP 含量顯著高于其他3 個(gè)處理組（P＜ 0.05)，CK 最低；C1的NDF 含量顯著低于其他3 個(gè)處理組（P＜ 0.05)；各處理組的ADF 含量無顯著差異（P＜ 0.05)；各處理的WSC 含量均較低，其中CK 顯著低于其他3 個(gè)處理組（P＜ 0.05) （表4)。

表4 酶制劑對(duì)混合青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分及有氧穩(wěn)定的影響Table 4 Effect of enzyme preparation on nutrient composition and aerobic stability of mixed silage

C2有氧穩(wěn)定性最好，達(dá)到240 h，C1有氧穩(wěn)定性達(dá)到212 h，而C3和CK 的有氧穩(wěn)定性較差，分別為50 h 和52 h （表4)。

3 討論

3.1 纖維素酶制劑對(duì)青貯品質(zhì)的影響

纖維素酶和木聚糖酶可降解植物細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)性碳水化合物（纖維素或半纖維素等)，產(chǎn)生可溶性碳水化合物，為青貯過程中乳酸菌的繁殖提供底物。青貯飼料中添加纖維素酶和木聚糖酶等酶制劑對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改善效果不盡相同，或受添加酶種類、添加量以及青貯原料種類的影響。張適等[14]在玉米秸稈青貯中分別添加10 000 U·kg-1的纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-葡聚糖酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有酶處理組的氨態(tài)氮/總氮顯著降低（P＜ 0.05)，可溶性糖含量顯著升高（P＜ 0.05)；纖維素酶處理組的粗蛋白質(zhì)含量顯著升高（P＜ 0.05)；β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶處理組的中性洗滌纖維含量顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05)。葉杭等[15]發(fā)現(xiàn)，隨著木糖酶添加量的增大，低水分（37.5%)水稻秸稈青貯飼料的pH、中性洗滌纖維含量顯著下降（P＜ 0.05)；可溶性碳水化合物含量有上升趨勢(shì)，但酸性洗滌纖維含量無顯著影響（P＞ 0.05)。趙金鵬等[16]在添加纖維素酶處理的水稻秸稈青貯時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，青貯60 d 后，與未添加的對(duì)照處理組相比，纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量降低幅度（39 g·kg-1)遠(yuǎn)大于酸性洗滌纖維含量降低幅度（11 g·kg-1)；且纖維素含量和半纖維素含量均顯著低于未添加對(duì)照組（P＜ 0.05)。陳光吉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿和皇竹草（Pennisetum sinese)為主的發(fā)酵TMR 飼料中添加纖維素酶和木聚糖酶的復(fù)合粉劑（酶活力分別為7 864.26 和3 918.47 U·kg-1)發(fā)酵49 d后，發(fā)現(xiàn)0.8～1.6 g·kg-1添加量制備的發(fā)酵TMR 發(fā)酵品質(zhì)較好（pH 較低)；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05)，具有較高的纖維素酶和木聚糖酶活力，另外羧基肽酶和酸性蛋白酶活力均下降，這意味著外源纖維素酶和木聚糖酶的添加促使青貯飼料的纖維素得到分解而降低了蛋白質(zhì)的損失。本研究中亦發(fā)現(xiàn)3 種酶處理組的pH 顯著低于未添加的對(duì)照組（P＜ 0.05)；纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量和氨態(tài)氮/總氮顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05)，木聚糖酶和混合纖維素酶處理組的中性洗滌纖維含量低于對(duì)照組，但沒有顯著差異（P＞ 0.05)；3 種酶處理組的酸性洗滌纖維含量與對(duì)照亦沒有顯著差異（P＞ 0.05)。乳酸菌[18]、甲酸、糖蜜[19]、纖維素酶或木聚糖酶等青貯添加劑均可降低青貯飼料中性洗滌纖維含量，但青貯添加劑對(duì)酸性洗滌纖維含量的影響不盡相同，這可能與中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的組成有關(guān)，易降解的部分以半纖維素為主。

3.2 綠狐尾藻混合青貯可行性

綠狐尾藻有發(fā)達(dá)的根狀莖，在富含氮磷的水體中生長(zhǎng)迅速，能高效去除污染的水體（含底泥)中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮等，常用于建植三級(jí)綠狐尾藻表面流人工濕地（三層去污，逐級(jí)遞進(jìn))處理養(yǎng)豬廢水[20-21]，濕地出水優(yōu)于《國(guó)家畜禽養(yǎng)殖污水排放標(biāo)準(zhǔn)》，本研究采用三級(jí)綠狐尾藻表面流人工濕地中第三層濕地生長(zhǎng)的綠狐尾藻為試驗(yàn)材料，前人研究表明，綠狐尾藻植株體內(nèi)各項(xiàng)離子指標(biāo)均達(dá)到可飼用標(biāo)準(zhǔn)[22]。綠狐尾藻年產(chǎn)鮮草600～900 t·hm-2，平均折合干物質(zhì)75 t·hm-2。凈化水體后的大量綠狐尾藻急需資源化利用，青貯是飼料化利用的有效方法之一。孫茜等[23]添加不同的乳酸菌劑制備綠狐尾藻青貯飼料，因青貯原料含水量較高（77%)，青貯發(fā)酵30 d 后pH 在4.71～5.68，發(fā)酵品質(zhì)較差。而本研究中利用玉米粉、秸稈粉與綠狐尾藻進(jìn)行混合青貯，降低了青貯原料含水量，且補(bǔ)充了乳酸菌發(fā)酵所需的底物，在不添加纖維素酶制劑的情況，仍可獲得較好的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，而添加纖維素酶或木聚糖酶后可有效改善營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，并提高有氧穩(wěn)定性。

本研究中纖維素酶、木聚糖酶和復(fù)合纖維素酶制劑的添加劑量參考了飼料添加劑來源公司的推薦量以及之前在紫花苜蓿（Medicago sativa)等同批酶制劑青貯添加劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（劑量試驗(yàn)數(shù)據(jù)未發(fā)表)。從成本效益角度考慮，纖維素酶類添加劑較乳酸菌制劑費(fèi)用更高，但從本研究結(jié)果來看，較乳酸菌制劑，酶制劑能更有效改善綠狐尾藻混合青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性；在目前研究基礎(chǔ)上，后期可考慮將纖維素酶與乳酸菌或糖蜜等復(fù)配添加，降低纖維素酶的添加量，增加綜合經(jīng)濟(jì)效益。另外，還可對(duì)綠狐尾藻混合青貯的吸附料選擇、添加劑選擇、綠狐尾藻青貯料飼用價(jià)值評(píng)價(jià)等進(jìn)行深入研究，以加快綠狐尾藻飼料化進(jìn)程。

4 結(jié)論

以70%綠狐尾藻 + 15%水稻秸稈 + 15%玉米粉為原料可以制備發(fā)酵品質(zhì)較好的青貯飼料；添加酶制劑可以顯著降低pH 和氨態(tài)氮/總氮，提高可溶性碳水化合物含量；其中添加纖維素酶（C1)可顯著提高混合青貯飼料的粗蛋白質(zhì)含量（P＜ 0.05)，顯著降低中性洗滌纖維含量（P＜ 0.05)，且具有較好的有氧穩(wěn)定性和發(fā)酵品質(zhì)，是綠狐尾藻混合青貯酶制劑添加較好的選擇。