劉倩倩，譚宇塵，姚寶輝，康宇坤，蘇軍虎,3

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 / 中—美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)—新西蘭梅西大學(xué)草地生物多樣性研究中心, 甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省祁連山草原生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站, 甘肅 蘭州 730070）

微衛(wèi)星DNA 也稱為簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR)，通常是由1～6 個核苷酸重復(fù)單元構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)序列，在真核生物基因組中，微衛(wèi)星DNA 絕大多數(shù)位于基因非編碼區(qū)，但也存在于編碼序列及外顯子中[1-2]。微衛(wèi)星具有分布廣泛、高度多態(tài)性及共顯性遺傳等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于確定種群間的遺傳分化、估計種群結(jié)構(gòu)和種群的遺傳多樣性研究中[3]。微衛(wèi)星DNA 按照其來源可分為基因組SSR （genomic simple sequence repeat,gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR （expressed sequence tagssimple sequence repeat, EST-SSR)。與gSSR 相 比，EST-SSR 來源于DNA 的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，其開發(fā)成本低、速度快，具有良好的物種間通用性且數(shù)量大等特點[4]，已成為對缺少基因組數(shù)據(jù)信息的生物進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)的有效方法之一。

高原鼢鼠（Eospalax baileyi)隸屬于嚙齒目鼴形鼠科鼢鼠亞科凸顱鼢鼠屬，是青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的特有種，它們的大部分活動均在地下洞穴系統(tǒng)中進(jìn)行，主要依靠植物的地下貯存器官作為食物[5]。近年來，在自然因素和人為活動的影響下，高原鼢鼠的高密度種群加速了草地退化，危及青藏高原生態(tài)安全和區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[6]。隨著國家生態(tài)安全戰(zhàn)略的實施，高原鼢鼠在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中的有效管理備受重視，然而有效的防控工作不僅需要了解高原鼢鼠的生物學(xué)特性，還需要了解其種群生態(tài)作用和種群生態(tài)學(xué)等方面的知識[7]。已有研究表明高原鼢鼠在不同地理種群間存在著限制性基因流，會導(dǎo)致種群分化與種群遺傳結(jié)構(gòu)改變[8-9]，影響到群體遺傳多樣性和繁殖策略，進(jìn)而影響高原鼢鼠的種群動態(tài)及其防控決策[10]。但對于高原鼢鼠種群自身的近交回避、親權(quán)識別和繁殖策略等問題至今仍然知之甚少，解決這些問題對于高原鼢鼠的有效管理至關(guān)重要，因此迫切需要有效的分子生物學(xué)技術(shù)和方法得以應(yīng)用。

近年來，學(xué)者們利用線粒體基因細(xì)胞色素b[11]和D-loop 區(qū)[12]等測序方法研究了不同群體高原鼢鼠的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。關(guān)于高原鼢鼠核基因組微衛(wèi)星位點開發(fā)也有零星的報道，Su 等[13]基于454 高通量測序，獲得了12 個微衛(wèi)星位點?？涤罾さ萚14]分析并驗證了跨種的通用性，但相較于模式生物和其他生物具有上千個微衛(wèi)星位點，高原鼢鼠現(xiàn)有的40 多個微衛(wèi)星位點仍無法滿足不同地理群體的分析需求，還需更多的微衛(wèi)星位點進(jìn)行婚配方式、遺傳結(jié)構(gòu)和基因流等檢測，而迄今對高原鼢鼠的EST-SSR 標(biāo)記篩選未見報道。鑒于此，本研究基于Illumina HiSeq 測序平臺，測定高原鼢鼠的特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，分析其分布特征，并對這些SSR 位點在高原鼢鼠中的多態(tài)性進(jìn)行驗證，以期篩選出具有高多態(tài)性的高原鼢鼠EST-SSR 引物，旨在為其種群遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)等相關(guān)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用高原鼢鼠63 只，其中雌性46 只，雄性17只，樣本采集于甘肅省甘南州碌曲縣境內(nèi)（100°46′—104°44′ E，33°06′—36°10′ N)，用活捕籠非損傷性捕捉，麻醉處死，迅速剖取其大腦組織，存入液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，采集腿部肌肉保存?5%酒精中，用于基因組DNA 的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及EST-SSR 序列的獲得

取24 只高原鼢鼠，雌雄各12 只，每只取0.3 g 新鮮的大腦組織，用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit （Takara，日本)提取總RNA，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop-2000 紫外分光光度儀檢測總RNA的濃度和純度，送樣至北京諾禾致源科技股份有限公司構(gòu)建cDNA 文庫，利用Illumina HiSeq 平臺進(jìn)行測序，對其得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行評估、過濾（去除接頭、低質(zhì)量區(qū)域等)，用Trinity-v2.5.1 軟件進(jìn)行拼接組裝[15]，共得到46 858 條unigenes，利用SSR 分析軟件MISA 1.0（http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)搜索高原鼢鼠組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中潛在的SSR 位點[16]。

1.2.2 DNA 的提取及檢測

選擇63 只高原鼢鼠腿部肌肉組織（保存于95%酒精中)為試驗材料，運用常規(guī)的酚氯仿抽提法提取基因組DNA。通過紫外分光光度計檢測DNA 的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量，-20 ℃保存。

1.2.3 引物的合成及PCR 擴(kuò)增

基于轉(zhuǎn)錄組測序得到的29 090 條序列，用Primer 3.0 軟件設(shè)計引物，共隨機(jī)選取104 對引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系總體積25 μL，其組成為2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 微衛(wèi)星基因型分型

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出清晰條帶后，利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行初步多態(tài)性篩選，篩選出12 對引物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，在正向引物5’末端用FAM、HEX 及TAMR 3 種熒光染料標(biāo)記，送至上海生工生物工程股份有限公司，用ABI 3 730 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。

1.2.5 微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析

用GeneMapper 4.0 對SSR 分型后得到的熒光電泳圖譜進(jìn)行判讀，并進(jìn)一步人工校正，獲取每個微衛(wèi)星位點在不同個體上的等位基因片段大??；用POPGENE 1.32 統(tǒng)計等位基因數(shù)（number of alleles,Na)，計算觀測雜合度（observed heterozygosity, Ho)和期望雜合度（expected heterozygosity, He)；用Cervus 3.0計算多態(tài)信息含量（polymorphism information content,PIC)并檢驗哈迪—溫伯格平衡（Hardy—Weinberg equilibrium, HWE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)類型分析

對高原鼢鼠的轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，完美型微衛(wèi)星是最常見的類型，共有29 090 個，其次是復(fù)合型微衛(wèi)星，不完美型微衛(wèi)星數(shù)量最少，只有1 001 個。本研究僅對高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組中1～6 堿基重復(fù)完美型SSR 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，對高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組中46 858 條unigenes 的數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，共找到29 090 個微衛(wèi)星位點，分布在7 306 條unigenes中，發(fā)生頻率（含有SSR 的unigenes 數(shù)量與總unigenes數(shù)量之比)為25.12%。在高原鼢鼠SSR 重復(fù)基序中，以單核苷酸重復(fù)單元的SSR 含量最多，所占比例為56.57%，其次是二核苷酸及三核苷酸重復(fù)，所占比例分別為28.65%和10.17%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)的SSR 類型較少，共占4.61% （表1)。

表1 高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點重復(fù)次數(shù)及長度Table 1 Repeats and length analysis of SSRS microsatellite loci in the transcriptome of the plateau zokor

2.2 轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星優(yōu)勢重復(fù)單元堿基組成

在高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組29 090 個微衛(wèi)星位點中發(fā)現(xiàn)重復(fù)堿基類型共有227 種，其中單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)分別有2、8、29、91、55 和42 種。其中四堿基重復(fù)類型最多。轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)在5～64 次，單核苷酸重復(fù)次數(shù)種類最多，為10～64 次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)分布在6～37 次。從合計看，在高原鼢鼠SSR 重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是10 次，有5 780 個，占19.87% （表2)。單堿基重復(fù)A/T 為重復(fù)次數(shù)最多的SSR 類型，占總數(shù)的54.31%，CA/TG 是二堿基重復(fù)的主要重復(fù)單元，共2 629 個，8 種類型的二堿基重復(fù)類型占微衛(wèi)星重復(fù)的36.53%，GCC/GGC 和CAAA/TTTG 分別是三堿基、四堿基的主要重復(fù)單元，分別有343 和103 個，占總數(shù)的1.18%和0.35% （圖1)，而五堿基、六堿基重復(fù)單元由于數(shù)量較少、分布松散，分別只有163、50 個，各重復(fù)類型分布較為均勻，由于其相應(yīng)的SSR 總數(shù)較少，且每種基元中均只有1 個SSR，故不作比較。

表2 基于高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的不同類型微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)量統(tǒng)計Table 2 Repeated number statistics of different types of SSRS based on the transcriptome data of the plateau zokor

圖1 基于重復(fù)類型的微衛(wèi)星分布Figure 1 Distribution of microsatellites based on repeat types

2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星位點篩選

從高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)篩選出104 個符合引物設(shè)計要求的EST—SSR 位點進(jìn)行引物合成，其中重復(fù)微衛(wèi)星數(shù)量以四堿基最多，有52 個，二堿基為43 個，三堿基為 18 個。以63 個高原鼢鼠基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)果顯示有12 對引物能夠在高原鼢鼠個體肌肉組織DNA 中成功擴(kuò)增，表現(xiàn)出特異性擴(kuò)增產(chǎn)物且大小符合，擴(kuò)增成功且在這些個體的擴(kuò)增產(chǎn)物中均可找到2 個以上的等位基因，即呈現(xiàn)出多態(tài)性。對12 對SSR 引物在63 個高原鼢鼠個體中的擴(kuò)增片段進(jìn)行統(tǒng)計（表3)得出，共獲得76 個等位基因， 每個位點產(chǎn)生等位基因數(shù)Na 為3～12 個，Ho 為0.263～0.937，平均值為0.651。He 為0.285～0.844，平均值為0.600。PIC 在0.251～0.816，其中有7 個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性，5 個位點為中度多態(tài)性。使用Bonferroni校正后，有2 個微衛(wèi)星位點顯著偏離哈迪—溫伯格平衡（P＜ 0.01)，10 個微衛(wèi)星位點未觀察到顯著的連鎖不平衡（P＞ 0.01)。

表3 12 對高原鼢鼠微衛(wèi)星位點的遺傳特征Table 3 Analysis of genetic characteristics of 12 pairs of Eospalax baileyi microsatellite loci

3 討論

高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展使得SSR 標(biāo)記的開發(fā)變得簡單快捷，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行物種種群遺傳學(xué)研究已得到廣泛應(yīng)用[17]。目前，微衛(wèi)星位點開發(fā)主要是基于基因組文庫和轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行篩選的[18]，通過基因組數(shù)據(jù)可有效地分析SSR 的序列特征和功能，如涂飛云等[19]對大鼠（Rattus norvegicus)基因組各部分微衛(wèi)星位點的分布特點進(jìn)行了分析，為大鼠全基因微衛(wèi)星研究積累了寶貴的資料；馮丹丹等[20]測定了長爪沙鼠（Meriones unguiculatus)全基因組數(shù)據(jù)，從中篩選出了357 個符合標(biāo)準(zhǔn)的微衛(wèi)星位點，結(jié)果有135 個擴(kuò)增成功。轉(zhuǎn)錄組測序是第二代高通量測序技術(shù)一個發(fā)展較為迅速的重要應(yīng)用[21]，對于缺失基因組數(shù)據(jù)的高原鼢鼠來說，利用篩選效率高、工作量較小的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行微衛(wèi)星位點的篩選是一種有效的方法。本研究共發(fā)現(xiàn)29 090 個高原鼢鼠的微衛(wèi)星，其發(fā)生頻率為25.12%，與以往學(xué)者關(guān)于密斑刺鲀（Diodon hystrix)轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點的發(fā)生頻率結(jié)果相近[22]，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報道的斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus)[23]、黃姑魚（Nibea albiflora)[24]等物種，因此微衛(wèi)星位點的分布頻率還因物種和組織不同而不同。轉(zhuǎn)錄后的unigene 是通過剪接產(chǎn)生的，有些微衛(wèi)星其重復(fù)單元可能是內(nèi)含子剪除后，兩側(cè)外顯子拼接而成的，其本身在基因組DNA 上并不是微衛(wèi)星[25]，其多態(tài)性可能是落后的分型技術(shù)產(chǎn)生的?，F(xiàn)階段最常用于微衛(wèi)星分型的方法有聚丙烯酰胺凝膠（polyacylamide gel electrophoresis,PAGE)和毛細(xì)管熒光電泳（capillary electrophoresis,CE)，與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比較，毛細(xì)管電泳準(zhǔn)確性更高、速度更快且儀器操作可自動化[26]。因此本研究采用高靈敏度的毛細(xì)管熒光電泳來檢測每個位點的多態(tài)性。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星測序結(jié)果，在高原鼢鼠中微衛(wèi)星重復(fù)單元以單核苷酸重復(fù)最多，原因可能是A/T 含量高的序列退火溫度較低，易導(dǎo)致DNA 解鏈造成微衛(wèi)星序列滑動錯配的可能性增加；其次為二核苷酸重復(fù)及三核苷酸重復(fù)類型，呈現(xiàn)隨著堿基數(shù)增加微衛(wèi)星數(shù)量逐漸減少的現(xiàn)象，該結(jié)果與大熊貓（Ailuropodamelanoleuca)、興國紅鯉（Cyprinus carpiovar.singuonensis)等的轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星組成情況相似[27-28]，但不同物種的微衛(wèi)星堿基重復(fù)類型仍存在種屬間差異。

高原鼢鼠營地下獨居生活，穩(wěn)定的生活環(huán)境和有限的遷移能力使得該物種的變異性較小，進(jìn)化潛力較弱，擴(kuò)散能力有限[29]。與地面活動的嚙齒類動物相比，高原鼢鼠種群結(jié)構(gòu)的特殊性在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著不可替代的地位，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，迫切需要有效的技術(shù)手段對其遺傳資源進(jìn)行開發(fā)利用。目前對于高原鼢鼠種群生態(tài)學(xué)方面的研究，大多數(shù)均從生物學(xué)特性入手，研究其在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中的作用及其分布與防治措施，而對于研究高原鼢鼠種群遺傳分化、種群間的擴(kuò)散特點等眾多問題還需要有效的分子生物學(xué)手段[30]。唐利洲等[8]以線粒體細(xì)胞色素b基因作為分子標(biāo)記，對不同地理種群間的高原鼢鼠個體進(jìn)行研究，結(jié)果顯示其種群間存在嚴(yán)重的限制性基因流。隨后蔡振媛等[11]測定了采自青藏高原東部不同地理種群高原鼢鼠個體的線粒體基因組序列變異情況，發(fā)現(xiàn)主要是地理隔離所導(dǎo)致的種群間遺傳分化，并且地理隔離對高原鼢鼠的作用大于甘肅鼢鼠（Eospalax cansus)。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已成功應(yīng)用于高原鼢鼠的種群遺傳多樣性分析中，劉麗等[31]利用10 個中度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，探討不同地理種群高原鼢鼠的遺傳結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)對種群個體信息交流起到阻礙作用的主要是河流和公路。在Su 等[13]和康宇坤等[14]的研究中，二者利用了高原鼢鼠近緣種鼴形鼠科和甘肅鼢鼠中已開發(fā)出的微衛(wèi)星位點，在高原鼢鼠中進(jìn)行了跨種擴(kuò)增，有部分微衛(wèi)星位點呈現(xiàn)出多態(tài)性，為高原鼢鼠微衛(wèi)星標(biāo)記的運用奠定了基礎(chǔ)。但高原鼢鼠僅有上述的微衛(wèi)星標(biāo)記還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，本研究篩選出的104 個轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點中僅成功擴(kuò)增出12 個條帶清晰且具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，大部分微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為單態(tài)性，原因可能是轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星主要分布于外顯子上，其多態(tài)性受到選擇壓力及突變等的影響要比其他區(qū)域的微衛(wèi)星低，因而多態(tài)性較低[32]。群體的遺傳多樣性可以通過等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量來反映[33]。本研究篩選出12 對引物能夠產(chǎn)生特異性擴(kuò)增產(chǎn)物且均呈現(xiàn)出中度及高度多態(tài)性，表明該群體處于中高度多態(tài)性，與Li 等[34]在高原鼠兔（Ochotona curzoniae)及Ingram等[35]在常年營地下生活的裸鼴鼠（Heterocephalus glaber)中篩選的微衛(wèi)星位點相比，大多數(shù)位點的等位基因數(shù)量較少，雜合度水平較低，且有2 個位點顯著偏離哈迪—溫伯格平衡，原因可能是所選高原鼢鼠群體較小，大多數(shù)等位基因差異存在于群體間和區(qū)域間，特殊地下生境使得群體內(nèi)變異較小，導(dǎo)致近交，也有可能是由于無效等位基因的存在，被視為純合子，增加了純合子比例[36]。

本研究基于高原鼢鼠轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)出的12 對微衛(wèi)星標(biāo)記為進(jìn)一步尋找更多、更有效的高原鼢鼠高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點提供了合適的工具，為進(jìn)一步研究高原鼢鼠種群內(nèi)部親緣關(guān)系及遷移擴(kuò)散等生態(tài)學(xué)問題奠定了基礎(chǔ)，為高原鼢鼠種群遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。