袁 寧，特日格樂，孫 林，賈玉山，格根圖，王志軍，盧 強，李宇宇，李俊峰，孫鵬波

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原資源環(huán)境學(xué)院 / 農(nóng)業(yè)部飼草栽培加工與高效利用重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

揮發(fā)性成分是一類具有低分子量、高蒸氣壓、低水溶性特點的化合物，在20 ℃、0.01 kPa 下能快速揮發(fā)，成為氣相狀態(tài)[1]。揮發(fā)性成分主要包括醇、醛、酮、酯、酸、烯烴等物質(zhì)，它們是自然界動植物信息交流的重要介質(zhì)，植物代謝所釋放的揮發(fā)性成分不僅能夠調(diào)節(jié)植物自身生長發(fā)育，而且對于抵御病蟲害有著重要作用[2-4]。揮發(fā)性成分對氣候變化的影響也日益明顯，國外研究者認(rèn)為隨著亞馬孫雨林面積的不斷減少，雨季中異戊二烯的下降趨勢明顯，這可能是雨林生物量減少所致，旱季時倍半萜烯與異戊二烯的比例上升趨勢明顯，這表明氣候變化引起的溫度上升使得揮發(fā)性成分的排放量發(fā)生變化[5]。研究顯示植物釋放的揮發(fā)性成分能顯著改善空氣質(zhì)量，使空氣中負(fù)離子顯著增加[6]。國內(nèi)外學(xué)者對于揮發(fā)性成分的研究多集中在環(huán)境保護(hù)方面，植物釋放的揮發(fā)性成分對于小氣候的形成和環(huán)境的改善有顯著作用[6]。飼用型牧草的揮發(fā)性成分是影響飼草適口性的關(guān)鍵因素，新鮮苜蓿干草有著濃郁的草香味，家畜的采食量高，而隨著貯藏時間的延長干草因微生物的代謝作用而產(chǎn)生酸味、霉味等氣味，導(dǎo)致家畜采食量明顯下降。錢佳成和宋偉[7]研究發(fā)現(xiàn)玉米（Zea mays)籽實含水量為14%～15%，儲藏溫度 ＞ 25 ℃時極易霉變，含水量低的玉米籽實苯乙醇含量較高，通過香蘭素、不飽和烯烴、不飽和烯醇化合物可有效判斷玉米儲藏狀態(tài)。萬立昊等[8]研究玉米霉變發(fā)現(xiàn)二氫-β-紫羅蘭酮、欖香烯、棕櫚酸、3-辛酮等的含量在玉米霉變后檢出量較高且刺激性氣味較重。鄭云飛[9]研究發(fā)現(xiàn)稻谷隨著儲藏時間的延長醛類和酮類物質(zhì)逐漸降低。由此推斷儲備多年的飼草適口性變差，家畜采食量降低，可能與紫花苜蓿（Medicago sativa)揮發(fā)性成分主要貢獻(xiàn)物質(zhì)的降低有關(guān)，飼草喪失了原本的草香味，家畜不喜采食，儲備多年的飼草家畜采食量顯著降低。因此，明晰牧草揮發(fā)性成分的變化，對于飼草安全貯藏與養(yǎng)殖業(yè)安全生產(chǎn)具有重要作用。

紫花苜蓿是豆科苜蓿屬飼草作物，高蛋白、低纖維、維生素礦物質(zhì)豐富、氨基酸種類齊全、飼用價值高等優(yōu)勢使得其在世界范圍內(nèi)廣泛種植，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國苜蓿產(chǎn)業(yè)的種植、收獲、加工、貯藏技術(shù)也不斷向著機械化、科學(xué)化、綜合化發(fā)展[10-11]。如何提高苜蓿品質(zhì)也成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素，其中苜蓿的揮發(fā)性成分是影響苜蓿適口性的關(guān)鍵因素。本研究采用頂空固相微萃取—氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction—gas chromatography—mass spectrometry, HS—SPME—GC—MS)技術(shù)，探討萃取溫度、解析溫度、萃取時間、解析時間對紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類與含量的影響，在最佳萃取條件下對揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量分析，旨在為紫花苜蓿揮發(fā)性成分鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

萃取條件對揮發(fā)性成分的種類與含量有很大影響，本試驗通過單因素試驗探討不同萃取溫度、解析溫度、萃取時間、解析時間（表1)下采用GC-MS檢測出紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類與含量的差異，以期篩選出最佳萃取條件與該條件下紫花苜蓿揮發(fā)性成分的種類與相對含量。

表1 單因素試驗Table 1 Single factor test

1.2 試驗材料

試驗材料為2020 年6 月采自包頭市九原區(qū)鑫泰農(nóng)業(yè)有限公司的‘中苜三號’紫花苜蓿，干草含水量為12%，去除苜蓿干草中的雜草，0.147 mm 篩粉碎后裝入自封袋內(nèi)，保存在-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3 試驗儀器

1.4 測定方法

1.4.1 紫花苜蓿揮發(fā)性成分測定前處理方法

萃取前需將萃取頭在GC-MS 進(jìn)樣口進(jìn)行老化，老化溫度250 ℃，老化30 min。準(zhǔn)確稱取1.5 g 苜蓿干草樣品放入20 mL 頂空瓶中，用密封膠墊和鋁蓋進(jìn)行密封。頂空瓶放在磁力加熱攪拌器上使其均勻受熱，苜蓿干草中的揮發(fā)性成分可穩(wěn)定快速地?fù)]發(fā)出來，將老化后的萃取頭插入頂空瓶，纖維頭暴露在頂空瓶中使其充分吸附紫花苜蓿揮發(fā)性成分。吸附一段時間后，將萃取頭插入GC-MS 進(jìn)樣口內(nèi)，使載氣不斷將吸附到纖維頭上的揮發(fā)性成分吹入GC-MS中，進(jìn)行分析，每份樣品重復(fù)3 次。

1.4.2 氣相色譜—質(zhì)譜分析條件

氣相色譜—質(zhì)譜條件參考Laopongsit 等[12]、李宇宇等[13]方法。色譜條件：使用HP-5MS UI 石英毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，柱初溫為35 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1程序升溫至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃·min-1程序升溫至250 ℃，保持4 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純度氦氣（純度≥99.99%)，氦氣流速為1 mL·min-1，柱前壓為87.57 kPa，進(jìn)樣模式為分流，分流比為1 ∶ 20，進(jìn)樣方式為手動進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。電離方式EI 離子源，電子能量70 eV。質(zhì)量掃描范圍40～550 m·z-1，采集方式為全掃描方式，離子源真空度為7.2 × 10-7mTorr。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)NIST11 和NIST11s 數(shù)據(jù)庫對紫花苜蓿揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法求各化合物的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取溫度對紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，解析時間3 min，解析溫度250 ℃，萃取溫度20、40、50、70、90 ℃條件下探究紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類和相對含量的差異（表2)。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產(chǎn)生的化合物外，結(jié)果顯示隨著萃取溫度的升高，揮發(fā)性成分的種類逐漸增加。萃取溫度20 ℃下共檢出7 種化合物，其中醛類化合物2 種，占總揮發(fā)物的26.01%。醇類化合物2 種，占總揮發(fā)物的32.78%。酮類化合物2 種，占總揮發(fā)物的32.07%。酯類化合物1 種，占總揮發(fā)物的9.15%。

表2 不同萃取溫度下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 2 Variety and relative content of volatile components of alfalfa at different extraction temperatures

續(xù)表2（1)Table 2（Continued)

續(xù)表2（2)Table 2（Continued)

萃取溫度90 ℃下共檢出47 種揮發(fā)性成分，其中醛類化合物13 種，占總揮發(fā)物的14.08%。醇類化合物10 種，占總揮發(fā)物的11.7%。酮類化合物13種，占總揮發(fā)物的46.36%。酯類化合物6 種，占總揮發(fā)物的14.62%。酚類化合物2 種，占總揮發(fā)物的9.13%。烴類化合物1 種，占總揮發(fā)物的1.35%。雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的1.01%。

隨著萃取溫度升高，紫花苜蓿揮發(fā)性成分的總峰面積和出峰數(shù)逐漸增加（圖1)。但萃取溫度超過90 ℃后，高溫烘烤使紫花苜蓿失去原本鮮綠色，轉(zhuǎn)變?yōu)榻购稚橛薪购龤馕懂a(chǎn)生（圖2)，因此萃取溫度為90 ℃能使紫花苜蓿揮發(fā)性成分在不發(fā)生變性的情況下?lián)]發(fā)完全。

孟導(dǎo)找個位子坐下，打量起坐在柜臺前的來人。來客中等身材，戴著一副學(xué)究氣的眼鏡，一副文質(zhì)彬彬的打扮。年紀(jì)大概在3 5歲以后，頭發(fā)已經(jīng)有些斑禿?？磥砗妥约阂粯邮菑氖履X力工作的。嗯，不過孟導(dǎo)自己倒是毛發(fā)濃密，堅挺地把守著象征年紀(jì)的高地。

圖1 萃取溫度對紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積與峰個數(shù)的影響Figure 1 Effect of extraction temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

圖2 不同萃取溫度下紫花苜蓿的顏色變化Figure 2 Color changes of alfalfa at different extraction temperatures

2.2 萃取時間對紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取溫度90 ℃，解析溫度250 ℃，解析時間3 min，萃取時間40、50、60、70、80 min 條件下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類和相對含量的差異（表3)。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產(chǎn)生的化合物外，結(jié)果顯示萃取時間80 min時共檢測出52 種化合物，其中醛類化合物15 種，占總揮發(fā)物的19.31%。醇類化合物12 種，占總揮發(fā)物的21.74%。 酮 類 化 合 物9 種， 占 總 揮 發(fā) 物 的37.55%。酯類化合物6 種，占總揮發(fā)物的9.41%。酚類化合物2 種，占總揮發(fā)物的0.72%。烴類化合物5 種，占總揮發(fā)物的6.17%。雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的1.22%。芳香族化合物1 種，占總揮發(fā)物的3.57%。大部分化合物的保留時間在30 min 以內(nèi)，醛類、醇類、酮類化合物相對含量占比達(dá)總揮發(fā)物的70%以上，是揮發(fā)物中的主要成分。不同萃取時間下檢測到醛類化合物種類最多，酮類化合物的相對含量最高，其中β-紫羅蘭酮為含量最多的化合物，其次為苯乙醇。

表3 不同萃取時間下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 3 Variety and relative content of volatile components of alfalfa under different extraction times

續(xù)表3（1)Table 3（Continued)

續(xù)表3（2)Table 3（Continued)

隨著萃取時間的延長，紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，出峰個數(shù)呈先增加后下降再增加的趨勢，在萃取時間80 min 時總峰面積不再變化，出峰個數(shù)最多（圖3)，因此80 min是理想的萃取時間。

圖3 萃取時間對紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積與峰個數(shù)的影響Figure 3 Effect of extraction time on the total peak area and peak number of volatile components of alfalfa

2.3 解析時間對紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，萃取溫度90 ℃，解析溫度250 ℃，解析時間1、2、3、4、5 min 條件下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類和相對含量的差異。排除部分因萃取頭高溫分解和柱流失產(chǎn)生的化合物外，結(jié)果顯示解析時間1 min時檢測出42 種揮發(fā)性成分，但化合物的總峰面積較低，說明解析出化合物的含量較少。解析時間3 min時檢測出41 種化合物，總峰面積達(dá)到最大。解析時間超過3 min 后揮發(fā)性成分的種類和總峰面積同時開始下降（圖4)，因此解析時間3 min 可以將萃取頭上大部分化合物解析下來。

圖4 解析時間對紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積與峰個數(shù)的影響Figure 4 The influence of resolution time on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析時間1 min 時共檢測出42 種化合物（表4)，其中醛類化合物11 種，占總揮發(fā)物的22.36%。醇類化合物6 種，占總揮發(fā)物的20.90%。酮類化合物14 種，占總揮發(fā)物的41.44%。酯類化合物5 種，占總揮發(fā)物的10.40%。烴類化合物2 種，占總揮發(fā)物的2.04%。雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的1.34%。酚類化合物1 種，占總揮發(fā)物的0.77%。芳香族化合物1 種，占總揮發(fā)物0.78%。

表4 不同解析時間下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 4 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution times

續(xù)表4Table 4（Continued)

解析時間3 min 時共檢測出41 種化合物（表4)。其中醛類化合物12 種，占總揮發(fā)物的22.41%。醇類化合物6 種，占總揮發(fā)物的17.94%。酮類化合物11 種，占總揮發(fā)物的41.07%。酯類化合物5 種，占總揮發(fā)物的11.95%。烴類化合物3 種，占總揮發(fā)物的1.89%。雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的0.98%。酸類化合物1 種，占總化合物的0.24%。芳香族化合物1 種，占總化合物的3.48%。大部分化合物保留時間均在30 min 以內(nèi)，醛類、醇類、酮類化合物的相對含量占總化合物的80%以上，醛類化合物種類較多，酮類化合物相對含量較高。其中β-紫羅蘭酮、苯乙醇與二氫獼猴桃內(nèi)酯的相對含量較高。

2.4 解析溫度對揮發(fā)性成分種類與相對含量的影響

采用頂空固相微萃取法分析在萃取時間60 min，萃取溫度90 ℃，解析時間3 min，解析溫度230、240、250、260、270 ℃條件下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類和相對含量的差異。排除部分柱流失外，結(jié)果顯示隨著解析溫度的升高，紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積與出峰個數(shù)先增加后減少，在250、260 ℃同時檢測出55 種揮發(fā)性成分，但總峰面積在解析溫度250 ℃時達(dá)到最大（圖5)，因此選擇解析溫度250 ℃較為理想。

圖5 解析溫度對紫花苜蓿揮發(fā)性成分總峰面積與峰個數(shù)的影響Figure 5 Effect of resolution temperature on the total peak area and peak number of alfalfa volatile components

解析溫度250 ℃時共檢測出51 種化合物（表5)。其中醛類化合物15 種，占總揮發(fā)物的28.05%。醇類化合物10 種，占總揮發(fā)物的20.74%。酮類化合物9 種，占總揮發(fā)物的29.64%。酯類化合物3 種，占總揮發(fā)物的8.19%。烴類化合物11 種，占總揮發(fā)物的8.19%。雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的1.83%。芳香類化合物1 種，占總揮發(fā)物的1.25%。解析溫度250 ℃條件下化合物的種類最多，化合物的相對含量較高，大部分化合物保留時間基本在30 min 以內(nèi)，醛類化合物的種類較為豐富，酮類化合物的相對含量較高。

表5 不同解析溫度下紫花苜蓿揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 5 Variety and relative content of alfalfa volatile components under different resolution temperatures

續(xù)表5（1)Table 5（Continued)

續(xù)表5（2)Table 5（Continued)

3 討論

萃取條件對HS-SPME 的萃取能力有很大影響，白俊英等[14]、薛妍君等[15]研究表明高溫有利于揮發(fā)性物質(zhì)的吸附，萃取溫度低，揮發(fā)性成分揮發(fā)較慢或揮發(fā)不完全，達(dá)到平衡的時間較長。因此紫花苜蓿的揮發(fā)性成分種類較少，相對含量較低；隨著溫度的升高，分子運動加快，更能激發(fā)萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)的快速吸附，縮短達(dá)到平衡的時間，紫花苜蓿揮發(fā)性成分的種類較為豐富，相對含量較高。萃取溫度過高會破壞紫花苜蓿原有品質(zhì)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分發(fā)生變化。本研究表明萃取溫度超過90 ℃紫花苜蓿會產(chǎn)生焦糊味，且喪失原本的鮮綠色，導(dǎo)致部分化合物高溫分解變性，分析鑒定出的化合物極大可能不是紫花苜蓿原本的揮發(fā)物質(zhì)，因此90 ℃為理想萃取溫度，與侯佳寧等[16]研究結(jié)果一致。

頂空瓶中的樣品、頂空瓶上部空間與萃取纖維三者之間達(dá)到平衡所需的時間稱為萃取時間，通過加熱等方式均可以縮短萃取時間[17]。萃取時間主要受樣品本身的性質(zhì)影響較大，不同的樣品萃取時間不同。本研究顯示隨著萃取時間的增加揮發(fā)性成分總峰面積和出峰個數(shù)逐漸增加，到80 min 時基本穩(wěn)定，與李凱等[18]的研究結(jié)果一致。

解析時間是影響萃取效果最主要的因素[13]。解析時間短，載氣對萃取纖維吹掃不完全，導(dǎo)致樣品不能完全從萃取纖維上剝離，最終影響萃取效果，若萃取時間太長，由于進(jìn)樣口溫度達(dá)250 ℃，長時間的高溫會使萃取纖維脫落，產(chǎn)生流失，甚至可能污染進(jìn)樣口與色譜柱。本研究表明解析時間3 min、解析溫度250 ℃時萃取效果較好，與李宇宇等[13]的研究結(jié)果一致。

張靜靜等[19]研究顯示3-戊酮、順-2-戊烯醇、葉醇、4-甲基-1-戊醇、3-辛酮、2-乙基己醇、苯乙醇在紫花苜蓿中含量較高，同時作者推斷可能是這幾種物質(zhì)相互配比后對苜蓿害蟲具有吸引作用，該研究結(jié)果為苜蓿害蟲防治提供了理論依據(jù)。李存滿等[20]研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿揮發(fā)油中主要以酸、醇、酮、酯類化合物為主，這與本研究結(jié)果類似。劉照娟等[21]采用同時蒸餾法分析紫花苜蓿揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)植醇、β-紫羅蘭酮等6 種揮發(fā)性成分含量較高，這與本研究結(jié)果類似。

本研究中紫花苜蓿揮發(fā)性成分中醛類、酮類、醇類化合物的占比較高，其中β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇等化合物相對含量較高，對紫花苜蓿揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)較大。

4 結(jié)論

不同的萃取條件對紫花苜蓿揮發(fā)性成分的種類和含量有很大的影響，研究結(jié)果表明：萃取溫度90 ℃、萃取時間80 min、解析溫度250 ℃、解析時間3 min為最佳萃取條件。該萃取條件下紫花苜蓿中共檢測出52 種化合物，包括酮類化合物9 種，占總揮發(fā)物的37.55%；醇類化合物12 種，占總揮發(fā)物的21.74%；醛類化合物15 種，占總揮發(fā)物的19.31%；酯類化合物6 種，占總揮發(fā)物的9.41%；烴類化合物5 種，占總揮發(fā)物的6.17%；芳香族化合物1 種，占總揮發(fā)物的3.57%；雜環(huán)類化合物2 種，占總揮發(fā)物的1.22%；酚類化合物2 種，占總揮發(fā)物的0.72%。其中β-紫羅蘭酮含量可達(dá)到總揮發(fā)物的20%左右，反式-2-己烯醛、2-苯基乙醛、壬醛、癸醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3, 5, 5-三甲基環(huán)己-2-烯酮、胡薄荷酮等對紫花苜蓿揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)較大，由于醇類、酯類、烴類物質(zhì)有較高的閾值，因此對紫花苜蓿揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)可能不大。