鄒愛愛，魏亞琴，楊宇澤，曹 磊，孫康永杰，萬學(xué)瑞，王 川

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省科學(xué)院生物研究所/甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 厭氧微生物中心, 甘肅 蘭州 730000；3.北京市畜牧總站，北京 100107）

纖維素（cellulose)是植物細(xì)胞壁的主要成分，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包括農(nóng)作物和森林殘留物，是地球上最豐富的生物質(zhì)資源[1]。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，農(nóng)作物秸稈等的纖維素產(chǎn)量越來越多，為緩解環(huán)境污染和促進(jìn)能源循環(huán)利用，纖維素的生物降解現(xiàn)在已經(jīng)開始被廣泛研究。相比于化學(xué)和物理方法降解纖維素，生物降解法更加環(huán)保和高效，纖維素酶在生物降解利用纖維素的過程中起著關(guān)鍵作用[2]。牛瘤胃液中的微生物能分泌出活性較高的纖維素酶[3]。纖維素酶是纖維素降解的基礎(chǔ)生物酶，主要由外切β-葡聚糖酶（1, 4-β-D-glucan cellobilhydrolase,EC 3.2.1.91)、β-葡 萄 糖 苷 酶（β-1, 4-glucosidase, EC 3.2.1.21, BG)和 內(nèi) 切β-葡 聚 糖 酶（1, 4-β-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4)組成[4]。由eg基因所編碼的內(nèi)切葡聚糖酶作為纖維素酶系的主要成分，其結(jié)構(gòu)包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellulose binding domain)、連接橋（linker)和催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain)，這3 種結(jié)構(gòu)在纖維素降解中起著至關(guān)重要的作用[5]，該酶通過切割纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶隨機(jī)水解β-1, 4糖苷鍵，將長鏈的纖維素分子截?cái)?，產(chǎn)生大量含非還原性末端的小分子纖維素，之后在外切葡聚糖酶（由cbh基因編碼)和β-葡萄糖苷酶（BG)的共同作用下將纖維素徹底降解成葡萄糖[6]，從而實(shí)現(xiàn)纖維素的徹底降解，目前纖維素酶已被廣泛用于許多工業(yè)領(lǐng)域[7]。

目前，常見內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌（Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)具有價(jià)格低廉、生長速度快、培養(yǎng)要求簡單、重組子穩(wěn)定等的優(yōu)勢，在科研中得到廣泛的應(yīng)用[8]。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在著表達(dá)的蛋白常以包涵體的形式出現(xiàn)，導(dǎo)致蛋白純化困難和活性降低等一些問題[9]。乳酸菌為一種兼性厭氧菌，在厭氧環(huán)境下可以大量繁殖，它們產(chǎn)生的乳酸會(huì)導(dǎo)致生存環(huán)境中的pH 下降從而阻斷有害細(xì)菌的生長，將乳酸菌添加至飼料中可以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也可以防止飼料腐敗變質(zhì)[10]。作為食品級的菌株，具有GRAS （generally recognized as safe)認(rèn)證資格[10]，可被用作表達(dá)異源基因和抗原的遞送載體，并且在蛋白表達(dá)過程中不以包涵體的形式出現(xiàn)[11]?？蒲兄谐＠萌樗峋鷺?gòu)建的基因工程菌株在活菌疫苗、活性酶、細(xì)胞因子以及各種蛋白和多肽類等生產(chǎn)領(lǐng)域中顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用價(jià)值[12]。為獲得高產(chǎn)重組內(nèi)切葡聚糖酶的乳酸菌，本研究通過提取牛瘤胃液全基因組作為模板，克隆纖維素酶eg基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在乳酸菌中表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶，該工程菌株的構(gòu)建為重組內(nèi)切葡聚糖酶乳酸菌在飼料工業(yè)上的開發(fā)及利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

乳酸菌（L.lactisNZ9000)、大腸桿菌（E.coliDH5α)、載體pMG36e 均為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；牛瘤胃液（插管抽取)來源于天?？h某養(yǎng)殖場雄性黃牛。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min；LB 固體培養(yǎng)基添加16 g 瓊脂粉。GM17 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，大豆蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖5 g，蔗糖171 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，β-磷酸甘油二鈉（索萊寶公司) 19 g，加水至1 L，115 ℃高壓滅菌20 min；GM17 固體培養(yǎng)基加16 g 瓊脂粉。GM17-CMC-Na 固體培養(yǎng)基：在1 L 的GM17 固體培養(yǎng)基中加入10 g 羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na，來源于索萊寶公司)，邊加熱邊攪拌，待CMC-Na 溶解后，115 ℃滅菌20 min，用于剛果紅染色。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛瘤胃液微生物全基因組的提取及eg基因的克隆及序列分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)法提取牛瘤胃液微生物全基因組[13]。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫公布的芽孢桿菌屬的內(nèi)切纖維素酶序列設(shè)計(jì)引物，采用DNAStar7.1 生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物：F:5’ -CGAGCAAGAAGGAGATATACATGCAAAAAA AAGATTATCTCAGCTAATGAAACGGTCAATCTCT AA-3’（下劃線為SacⅠ的酶切位點(diǎn)，波浪線為添加的信號(hào)肽序列)，R:5’-GCTCTAGACTAATTTGGTTC TGTTCCCCA-3’（下劃線為XbaⅠ的酶切位點(diǎn))，將擴(kuò)增出的eg基因與pMD-18T 質(zhì)粒連接后送至天津金唯智公司測序后進(jìn)行Blast 比對并下載同源性相近的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。以牛瘤胃液微生物全基因組為模板用Taq 酶（諾唯贊有限公司)擴(kuò)增目的基因eg，PCR 反應(yīng)體系為94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min；PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用DNA 純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司)回收。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

使用兩種內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ （TaKaRa 公司)在37 ℃同時(shí)酶切eg基因和載體pMG36e 1 h，用T4 DNA 連接酶（Thermo Fisher 公司) 22 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR 和提取質(zhì)粒后用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證正確后并送至金唯智公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸菌及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

挑取劃線培養(yǎng)的乳酸菌NZ9000 單菌落接種于5 mL GM17 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)2 d，然后參照Holo 和Nes[14]的方法制作乳酸菌的感受態(tài)細(xì)胞，取測序正確的重組質(zhì)粒DNA 1 μL （100 ng·uL-1)加入到10 μL 的感受態(tài)細(xì)胞中混合均勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，電擊條件為2 200 V，200 Ω，25 μF，菌液復(fù)蘇3～4 h 后，涂布于GM17 （含2.5 μg·mL-1紅霉素)的固體平板上，置于30 ℃培養(yǎng)48 h 后，挑取GM17 平板上的單個(gè)菌落，將菌液煮沸10 min 后進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組乳酸菌NZ9000 用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 重組質(zhì)粒在乳酸菌中的表達(dá)

取驗(yàn)證正確的菌液按1 ∶ 100 的比例接種在GM17培養(yǎng)液中30 ℃靜止培養(yǎng)48 h 后，將菌液在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心10 min，取發(fā)酵上清液用預(yù)冷的10% TCA/丙酮沉淀蛋白質(zhì)，-20 ℃放置3 h 后于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2 次，室溫放置30 min，晾干徹底去除丙酮后加入1 mL ddH2O 溶解沉淀，分別將重組乳酸菌的菌液、培養(yǎng)液的上清液、菌體超聲破碎后的沉淀及重組蛋白和空質(zhì)粒重組菌的菌液、培養(yǎng)液的上清液、菌體超聲破碎后的沉淀制樣后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。

1.2.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶活檢測

采用剛果紅（索萊寶公司)染色法檢測該蛋白酶有無活性[15]，用DNS 法測出重組內(nèi)切葡聚糖酶OD550nm值（分光光度計(jì))并計(jì)算出酶活值[16]，試驗(yàn)組為重組乳酸菌發(fā)酵上清液濃縮蛋白，對照組為空質(zhì)粒重組菌發(fā)酵上清液的濃縮蛋白，使用濾紙酶活力（FPA)法檢測總酶活[17]，利用剛果紅染色法觀察水解圈及其直徑大小。

1.2.6 重組內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

最適反應(yīng)pH：在50 ℃的條件下，以1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)作為底物，溶解在磷酸鹽緩沖液（購于索萊寶公司)中，在pH 4、5、6、7、8、9、10 的條件下用DNS 法測定重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活值并計(jì)算出相對酶活力，最高酶活值記為100%[16]。

最適反應(yīng)溫度：在pH 為6 的條件下，設(shè)置30、50、60、70、90 ℃的溫度梯度，以1% CMC-Na 為底物，溶解在磷酸鹽緩沖液中，用DNS 法在各溫度下測定重組蛋白的酶活力，最高酶活力記為100%[16]。

底物水解能力分析：在pH 為6、反應(yīng)溫度為50 ℃的條件下分別以CMC-Na、濾紙（FPA)、脫脂棉、微晶纖維素（Avicel)為底物，溶解在磷酸鹽緩沖液中，用DNS 法測定重組蛋白酶活力，分析重組EG 蛋白對不同底物的水解能力[16]。

不同金屬離子對重組內(nèi)切葡聚糖酶活性的影響：在pH 為6、反應(yīng)溫度為50 ℃的條件下，以1% CMC-Na為底物，溶解在磷酸鹽緩沖液中，反應(yīng)體系中添加5 mmol·L-1的 金 屬 離 子（BaCl2、CaCl2、NaCl、HgCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2、CoCl2、ZnCl2、CuCl2、KCl)，用DNS 法測定重組內(nèi)切葡聚糖的酶活力，同時(shí)以未加金屬離子的重組乳酸菌粗酶液作為對照組，其酶活力計(jì)為100%，以此確定各種金屬離子對重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活的影響[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將以上數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件的ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan 法進(jìn)行多重比較后，用Graph Prism 8.0 軟件繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 eg 基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

經(jīng)PCR 擴(kuò)增和核苷酸序列測定后可知該基因大小為1 500 bp （圖1)；在NCBI 上通過Blast 進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該基因序列與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilisstrain SRCM102748)的eg基因相似性達(dá)100%；根據(jù)基因序列通過MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)所擴(kuò)增的eg序列是來自Bacillussubtilisstrain SRCM102748 菌 株（登 錄 號(hào) 為CP028212.1)。分別用SacⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶同時(shí)酶切重組質(zhì)粒pMG36e::eg和pMG36e 空質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，pMG36e::eg質(zhì)粒切出大小為1 500 bp 左右的條帶（圖1)，獲得的基因片段大小與預(yù)期大小相符，表明表達(dá)載體pMG36e::eg構(gòu)建成功。

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Figure 1 PCR amplification products of the target gene and identification of the recombinant plasmid bydouble enzyme digestion

圖2 eg 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 A phylogenetic tree of the eg gene in different microbial species

2.2 eg 基因在乳酸菌中表達(dá)的SDS-PAGE 分析

通過10% TCA/丙酮沉淀法濃縮重組乳酸菌發(fā)酵上清液中的蛋白后，將重組乳酸菌的菌液、培養(yǎng)液的上清液、菌體超聲破碎后的沉淀及空質(zhì)粒重組菌的菌液、培養(yǎng)液的上清液和菌體超聲破碎后的沉淀分別制樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明：空質(zhì)粒重組菌的菌液、上清液和沉淀均無目的蛋白出現(xiàn)，而重組乳酸菌培養(yǎng)液的上清液濃縮蛋白在50 kDa附近有明顯的條帶（圖3)，表明有目的蛋白表達(dá)。

圖3 SDS-PAGE 電泳Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis

2.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的測定

2.3.1 DNS 法和濾紙法測定重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力

用DNS 法測得內(nèi)切葡聚糖酶酶活為12.401 9 U·mL-1，濾紙法測得總酶活為12.246 9 U·mL-1，通過SPSS 19.0 軟件分析比較重組內(nèi)切葡聚糖酶和對照組酶活力值發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組顯著高于對照組酶活（P＜0.05) （表1)，說明該酶具有良好的酶活性。

表1 二硝基水楊酸法和濾紙法測定酶活力值Table 1 Determination of enzyme activity using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) and filter paper methods

2.3.2 重組內(nèi)切葡聚糖酶剛果紅染色

分別將經(jīng)SDS-PAGE 分析的樣品和ddH2O 作為空白對照加入GM17-CMC-Na 固體培養(yǎng)基中30 ℃孵育反應(yīng)12 h 后，發(fā)現(xiàn)空質(zhì)粒pMG36e 重組菌的菌液、培養(yǎng)液的上清液、菌體破碎后的沉淀和ddH2O空白對照均無水解圈，但重組菌培養(yǎng)液的上清液和重組蛋白酶出現(xiàn)明顯的水解圈，直徑分別為1.98 和2.32 cm （圖4)，說明該蛋白為分泌型表達(dá)且具有酶活力。

圖4 剛果紅染色水解圈Figure 4 Congo red stain zones of hydrolysis

2.3.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以CMC-Na 為底物測定重組內(nèi)切葡聚糖酶在不同pH 下的酶活，結(jié)果顯示最適反應(yīng)pH 為6；在pH為5～7 時(shí)耐受性良好；在反應(yīng)pH 低于5 時(shí)，酶活性降到很低（圖5A)。因此在研究重組蛋白酶的最適反應(yīng)溫度、不同底物的水解能力、不同金屬離子對重組蛋白影響的試驗(yàn)中反應(yīng)pH 均為6。

圖5 重組內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析Figure 5 Analysis of the enzymatic properties of the recombinant endoglucanase

重組內(nèi)切葡聚糖酶以CMC-Na 為底物，在反應(yīng)pH 為6 的條件下，當(dāng)反應(yīng)溫度低于70 ℃時(shí)，相對酶活力均低于60%，之后隨著溫度不斷升高，酶活力也不斷升高，當(dāng)溫度達(dá)90 ℃時(shí)重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶活值達(dá)到最高，最適反應(yīng)溫度為90 ℃（圖5B)。

重組內(nèi)切葡聚糖酶以CMC-Na、微晶纖維素、濾紙、脫脂棉為底物時(shí)均有一定酶活力，但以脫脂棉為底物時(shí)酶活力利用能力最低（圖5C)。

重組內(nèi)切葡聚糖酶以CMC-Na 為底物，在反應(yīng)pH 為6、溫度為50 ℃的條件下，Cu2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Co2+、Hg2+、K+等均可以提高重組酶的酶活力，而Fe2+抑制重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力（表2)。

表2 各種金屬離子對重組內(nèi)切葡聚糖酶相對酶活力的影響Table 2 Effects of different metal ions on the relative enzyme activity of the recombinant endoglucanase

3 討論

研究表明補(bǔ)充酶制劑可提高反芻動(dòng)物的飼料利用效率，減輕環(huán)境污染并控制某些疾病[18]。據(jù)報(bào)道瘤胃微生物產(chǎn)生的纖維素酶是迄今為止最活躍的酶之一[19]，其中瘤胃中的芽孢桿菌（Bacillus)可分泌多種纖維素酶和淀粉酶，本研究成功地克隆到Bacillus的纖維素酶eg基因并在乳酸菌中完成了表達(dá)。但因自然來源Bacillus所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)量低、活性低、難回收等問題，可將內(nèi)切葡聚糖酶基因在外源宿主中表達(dá)來解決這一問題。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因細(xì)胞快速生長、廉價(jià)的培養(yǎng)基和相對簡單的培養(yǎng)方法等優(yōu)點(diǎn)在科研中得到廣泛應(yīng)用。湯斌等[20]在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)了eg2基因，酶活值為1.321 U·mL-1，但蛋白不能分泌至胞外；寶力德等[21]通過在大腸桿菌中克隆表達(dá)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的eg基因，酶活力值達(dá)683 U·L-1，大多蛋白為包涵體表達(dá)。劉原子等[22]擴(kuò)增出多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)eg基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，測得酶活值為2.427 U·mL-1。雖然在該系統(tǒng)中可表達(dá)出重組內(nèi)切葡聚糖酶，然而一些報(bào)告描述了重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中不能正確折疊且純化困難，可能會(huì)產(chǎn)生非功能性蛋白質(zhì)[23]，且大腸桿菌易引起動(dòng)物機(jī)體損傷（如腹瀉等)，不易達(dá)到食品級的標(biāo)準(zhǔn)而難以滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。乳酸菌作為食品級的菌株，在蛋白表達(dá)過程中不以包涵體的形式出現(xiàn)，科研中常利用乳酸菌作為宿主細(xì)胞已成功表達(dá)出各種外源蛋白。Ozkose 等[24]克隆了來源于牛瘤胃厭氧真菌的Neocallimastixsp.的纖維素酶基因并在乳酸菌中完成表達(dá)，并將該重組蛋白酶添加至青貯飼料發(fā)現(xiàn)可提高纖維素的降解率。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)L.lactisNZ9000 是食品級安全表達(dá)系統(tǒng)且已被廣泛應(yīng)用，本研究所用質(zhì)粒pMG36e 來源于pWV01 載體，該載體的強(qiáng)啟動(dòng)子p32 具有可供多種細(xì)菌識(shí)別的核糖體位點(diǎn)可供表達(dá)蛋白，該質(zhì)粒大小約為3 600 bp，方便宿主菌攜帶[25]已在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)出各種酶[26-28]。王翠艷等[29]通過克隆綠色木霉（Trichoderma viride)纖維二糖水解酶基因cbhⅡ并利用質(zhì)粒pMG36e完成在乳酸菌中的表達(dá)，測得重組蛋白酶活值達(dá)16.7 U·mL-1。本研究設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物上游添加了一段信號(hào)肽序列，該段序列在基因表達(dá)過程中可引導(dǎo)蛋白向胞外持續(xù)分泌，實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，將已克隆得到的eg基因序列連接表達(dá)質(zhì)粒pMG36e 后電轉(zhuǎn)至乳酸菌中，成功分泌表達(dá)出內(nèi)切葡聚糖酶，蛋白分子大小為50 kDa 左右，與預(yù)期大小相符，1%羥甲基纖維素鈉GM17 培養(yǎng)基驗(yàn)證時(shí)產(chǎn)生明顯的水解圈，說明成功構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體，該內(nèi)切葡聚糖酶活力值為12.401 9 U·mL-1。而王瑾等[30]擴(kuò)增出eg基因，并在乳酸菌中表達(dá)，但測得蛋白酶無活性。本研究獲得的內(nèi)切葡聚糖酶的酶活與Nakazawa 等[31]測定的酶活相比，提高了24 倍，具有良好的酶活力。野生型的乳酸菌作為一類益生菌，是動(dòng)物腸道的正常菌群，將其添加至飼料中可促進(jìn)動(dòng)物消化，提高動(dòng)物免疫力，但無降解纖維素的能力[32]。謝驁李暢等[33]通過構(gòu)建重組乳酸菌并將其添加至飼料中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明重組乳酸菌可對秸稈植物性飼料均發(fā)揮一定的降解作用。本研究所獲得的重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH 為6，在pH 為5～7時(shí)耐受性良好，pH 穩(wěn)定性的結(jié)果高于在枯草芽孢桿菌IARI-SP-1 （Bacillus subtilisIARI-SP-1)、地衣芽孢桿菌AU01 （B.licheniformisAU01)、解淀粉芽孢桿菌DL-3 （B.amyloliquefaciensDL-3)等細(xì)菌上的報(bào)道[34-36]；各種金屬離子對該重組內(nèi)切葡聚糖酶的影響結(jié)果與朱涇等[37]試驗(yàn)結(jié)果相一致；該重組蛋白酶對不同底物的水解能力結(jié)果與Hakamada 等[38]報(bào)道的在Bacillussp.KSM-S237 上的試驗(yàn)結(jié)果相似；該重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度可達(dá)90 ℃，是一種耐高溫酶，市場潛力巨大，可廣泛應(yīng)用于多種耐高溫的工業(yè)生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

本研究成功將來源于牛瘤胃微生物的內(nèi)切葡聚糖酶在乳酸菌系統(tǒng)中進(jìn)行了克隆和表達(dá)，成功構(gòu)建了分泌型重組內(nèi)切葡聚糖酶的乳酸菌，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析。重組內(nèi)切葡聚糖酶的分子量約為50 kDa，所用表達(dá)載體pMG36e 不需要添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，只需正常培養(yǎng)重組乳酸菌就可在培養(yǎng)基上清液中獲得持續(xù)分泌的內(nèi)切葡聚糖酶，檢測到內(nèi)切葡聚糖酶活力為12.401 9 U·mL-1；重組內(nèi)切葡聚糖酶對CMC-Na、濾紙、微晶纖維素和脫脂棉均具有酶活力；最適反應(yīng)溫度為90 ℃；最適反應(yīng)pH 為6，在pH 5～7 內(nèi)具有較好的pH 耐受性；Cu2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Co2+等均可以提高重組蛋白的酶活力，而Fe2+抑制重組內(nèi)切葡聚糖酶活力。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室正在將該重組內(nèi)切葡聚糖酶作為纖維素酶制劑進(jìn)行青貯發(fā)酵試驗(yàn)，將其添加至飼料中是否達(dá)到提高動(dòng)物免疫力和飼料消化率的雙重效果，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。