鄭梅霞，肖榮鳳，陳梅春，陳燕萍，朱育菁

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的新型生物材料，以其良好的生物相容性、生物可降解性、生物適應(yīng)性以及高持水性、高結(jié)晶度、高彈性模量和高拉伸強(qiáng)度等獨(dú)特的理化性能（尤其是優(yōu)異的持水性能和吸水性能）廣泛應(yīng)用在于食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域[1?3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌常見的有醋酸菌屬[4?5]、根瘤菌屬[6]和土壤桿菌屬[7]等。其中，木葡糖酸醋桿菌因其較高的BC 產(chǎn)量而被廣泛應(yīng)用于研究生產(chǎn)，并作為模式菌株[8]。目前的干燥方法有很多，其中，熱風(fēng)干燥方式具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備成熟、不受氣候條件影響、成本低、適合大規(guī)模批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[9]。真空冷凍干燥方式是目前較好的食品加工干燥方式之一，能最大限度地保留農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分及可有效保持農(nóng)產(chǎn)品的色香味形，幾乎可以對(duì)所有的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行加工[10]。微波真空干燥方式綜合了微波干燥方式和真空干燥方式的優(yōu)點(diǎn)，使物料在低溫條件下均勻快速地干燥，干燥速度快、品質(zhì)高，具有高效節(jié)能、加熱均勻、易控、產(chǎn)品質(zhì)量好、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)[11]。不同培養(yǎng)方式、菌株、培養(yǎng)基和干燥方法等對(duì)細(xì)菌纖維素的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響較大，結(jié)構(gòu)差異必將引起其性能和應(yīng)用開發(fā)的差異[12?14]。馮勁等[2]用葡糖醋桿菌屬Gluconacetobacter intermedius所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素比較了60 ℃烘箱干燥、?20 ℃冷凍結(jié)實(shí)后冷凍干燥、液氮冷凍結(jié)實(shí)后冷凍干燥這3 種干燥方式，發(fā)現(xiàn)第3 種的干燥方法獲得的BC 復(fù)水性能最好。羅倉(cāng)學(xué)等[14]研究表明木醋桿菌Acetobacter xylinum所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素經(jīng)過(guò)熱風(fēng)干燥、微波干燥、梯度升溫冷凍干燥和真空冷凍升華干燥等4 種干燥方式干燥后，經(jīng)梯度升溫冷凍干燥的BC 復(fù)水性能最好。高含水量的細(xì)菌纖維素為其儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用帶來(lái)極大的不便，而經(jīng)干燥后的細(xì)菌纖維素吸水性大幅下降，有利于推廣應(yīng)用于食品行業(yè)[14]。研究者們?yōu)榱双@得溶脹性能好的BC，Lin 等[15]通過(guò)添加明膠增大BC 的溶脹性，Chen 等[16]通過(guò)添加凝膠肽改善BC 的溶脹性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同的干燥方法會(huì)影響B(tài)C 的結(jié)構(gòu)，改變BC 的物理性質(zhì)[2]，引起復(fù)水性能差異[14]。不同干燥方法應(yīng)避免BC 微纖維間氫鍵締合作用以提高其復(fù)水性能[17]。本研究將對(duì)本實(shí)驗(yàn)室獲得的木葡糖酸醋桿菌Komagataeibacter xylinusFM883 所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文研究采用熱風(fēng)干燥、微波真空干燥和真空冷凍干燥等幾種不同的干燥方式對(duì)菌株FM883 所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素進(jìn)行干燥，并測(cè)試分析不同干燥方式的細(xì)菌纖維素樣品的吸水性能，為后續(xù)對(duì)BC 的產(chǎn)品研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株FM883 為木葡糖酸醋桿菌K. xylinus，由本實(shí)驗(yàn)室篩選，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2019127，基因登錄號(hào)是MW757206。葡萄糖為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、磷酸氫二鉀和乙醇為分析純，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；酵母膏和瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，K2HPO40.1%，MgSO41.5%，乙醇2%，瓊脂2%，pH 值自然。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，K2HPO40.1%，MgSO41.5%，乙醇2%，pH 值自然。

1.2 儀器設(shè)備

JSM-6380LV 掃描電子顯微鏡（日本JEOL 公司），Panasonic MDF-DU102VXL-PC 超低溫保存箱（日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社），STIK 低溫生物培養(yǎng)箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]，海爾冰箱（型號(hào)為BCD-532WDPT），VirTis 6KBTEL-85 冷凍干燥機(jī)（美國(guó)VirTis 公司），電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱GSKP-01BII（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠），自組裝微波干燥機(jī)（由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所提供）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌纖維素的制備與純化 取一環(huán)在固體培養(yǎng)基上活化好的FM883 菌株接種入種子培養(yǎng)基中，150 r·min?130 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。再以10%的接種量接入1000 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。取出細(xì)菌纖維素，用去離子水多次淋洗，再用0.1 mol·L?1NaOH 溶液煮至呈乳白色半透明狀，去除殘留的菌體和培養(yǎng)基。然后用去離子水反復(fù)淋洗后，用0.5%醋酸中和使細(xì)菌纖維素pH 值為7.0。

1.3.2 細(xì)菌纖維素的干燥

（1）熱風(fēng)干燥：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱預(yù)熱70 ℃，將BC 放在箱內(nèi)干燥，每隔30 min 取出BC 稱重，直至恒重，所得樣品為BC-DD70。

（2）熱風(fēng)干燥：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱預(yù)熱50 ℃，將BC 放在箱內(nèi)干燥，每隔30 min 取出BC 稱重，直至恒重，所得樣品為BC-DD50。

（3）微波真空干燥：微波爐爐內(nèi)溫度設(shè)置為40 ℃，真空度為?0.08 MPa，微波功率2 KW，將BC 置于微波爐中干燥，每隔15 min 取出BC 稱重，直至恒重，所得樣品為BC-MVD。

（4）真空冷凍干燥：BC 先于?20 ℃凍結(jié)后，置于真空冷凍干燥機(jī)中，溫度?85 ℃，真空度16 Pa，干燥時(shí)間48 h，所得樣品為BC-FD20。

（5）真空冷凍干燥：BC 先于?80 ℃凍結(jié)后，置于真空冷凍干燥機(jī)中，溫度?85 ℃，真空度16 Pa，干燥時(shí)間48 h，所得樣品為BC-FD80。

1.3.3 形態(tài)觀察 觀察不同干燥方法獲得的細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)；通過(guò)電子掃描電鏡（SEM，JSM-6380LV，JEOL）檢測(cè)微觀結(jié)構(gòu)，在15.0 kV 的低真空下用二次電子操作，SEM 檢查之前用Au 涂覆樣品。

1.3.4 細(xì)菌纖維素復(fù)水性能 將1 g 不同方法干燥所得細(xì)菌纖維素置于去離子水中37 ℃浸泡一定時(shí)間（1、2、4、6、8、26、28、32、48、50、51、53、55、103、144、150 和156 h），用濾紙擦干表面水分后稱重，記為細(xì)菌纖維素吸水后的濕重。根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算細(xì)菌纖維素的溶脹率Qt（%）和每克干細(xì)菌纖維素的復(fù)水量M（g）。

式中：Me是細(xì)菌纖維素吸水平衡時(shí)的質(zhì)量（g）；M0是細(xì)菌纖維素干樣品的質(zhì)量（g）；Qt是細(xì)菌纖維素在t時(shí)間的溶脹率（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)觀察

不同干燥方式處理的細(xì)菌纖維素的外觀差異很大，如圖1 所示。BC-DD70（圖1-a）和BC-DD50（圖1-b）細(xì)菌纖維素干燥收縮成表面平滑的紙片狀，具有一定的透光性。BC-MVD（圖1-c）細(xì)菌纖維素干燥后變?yōu)楹稚埰瑺?。BC-FD20（圖1-d）和BC-FD80（圖1-e）細(xì)菌纖維素干燥后呈白色海綿狀，較為松軟。

圖1 不同烘干方式烘干后的細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)Fig. 1 Appearances of dried BC samples

不同干燥方式處理的細(xì)菌纖維素表面的微觀結(jié)構(gòu)如圖2 所示，BC-DD70 和BC-DD50 細(xì)菌纖維素的纖維排列較致密，形成大小各異的孔洞，而BCDD70 細(xì)菌纖維素的孔隙較BC-DD50 的更少。BCMVD 細(xì)菌纖維素的纖維排列最為致密，基本上沒有孔洞，因?yàn)槲⒉▓?chǎng)使極性水分子產(chǎn)生熱效應(yīng)，水分子能夠滲透到纖維素非晶區(qū)及晶區(qū)表面，造成纖維分子鏈間氫鍵的斷裂，并與纖維素分子形成新的氫鍵，且微波可能會(huì)造成內(nèi)部纖維素鏈的斷裂[11]。BCFD20 和BC-FD80 細(xì)菌纖維素形成層狀的三維空間纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，真空冷凍干燥是細(xì)菌纖維素在凍結(jié)狀態(tài)下干燥，水分透過(guò)BC 結(jié)構(gòu)縫隙升華逸出，使干燥后的BC 仍能保持原有結(jié)構(gòu)，但BC-FD20 和BC-FD80在局部纖維結(jié)構(gòu)上略有不同，BC-FD20 的纖維帶寬度更寬。

2.2 不同干燥方式細(xì)菌纖維素的復(fù)水性能比較

BC-DD70、 BC-DD50、 BC-MVD、 BC-FD20 和BC-FD80 每克干細(xì)菌纖維素的吸水量分別為（18.12±0.18）、（33.74±0.24）、（8.05±0.15） 、（42.63±0.13） 和（43.79±0.19） g，而沒有干燥的細(xì)菌纖維素含水量達(dá)（75.11±0.11） g。BC-FD80 每克吸水的量達(dá)到還沒干燥的細(xì)菌纖維素的58.30%。而BCDD70 和BC-MVD 的吸水能力分別只達(dá)到2.41%和10.72%。BC-DD70、BC-DD50、BC-MVD、BC-FD20和BC-FD80 的復(fù)水量如表1 所示，復(fù)水量為BC-FD80＞BC-FD20＞BC-DD50＞BC-DD70＞BC-MVD，造成復(fù)水量差異的原因是不同干燥方式引起的細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)變化，如圖2 所示。不同干燥方式細(xì)菌纖維素的復(fù)水量存在顯著性差異，說(shuō)明各種干燥方式對(duì)細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)影響很大。不同干燥方式獲得細(xì)菌纖維素的溶脹率與復(fù)水量的變化趨勢(shì)一樣，也存在顯著性差異。

圖2 掃描電子顯微鏡下的細(xì)菌纖維素Fig. 2 SEM micrographs of dried BC samples by various dehydration methods

表1 不同干燥方法的細(xì)菌纖維素的吸水性能Table 1 Water absorption of dried BC samples

BC-DD70、BC-DD50、BC-MVD、BC-FD20 和BCFD80 在時(shí)間t時(shí)的溶脹率Qt如圖3 所示，細(xì)菌纖維素溶脹到平衡的時(shí)間較長(zhǎng)，溶脹的速率快慢可分為0～10 h、10～60 h 和60～160 h 幾個(gè)階段。測(cè)試時(shí)，采取溶脹速度快時(shí)加密測(cè)試點(diǎn)；而當(dāng)溶脹速率降低時(shí)，則加大測(cè)試時(shí)間間隔，以便增加次數(shù)間的質(zhì)量差；臨近溶脹平衡時(shí)，加密測(cè)試幾個(gè)點(diǎn)，以質(zhì)量基本穩(wěn)定為測(cè)試終點(diǎn)。BC-FD20 和BC-FD80 的溶脹速率最高且變化幅度較大，在前60 h 復(fù)水過(guò)程中急劇增加，后趨于平緩，說(shuō)明經(jīng)過(guò)冷凍干燥的細(xì)菌纖維素吸水膨脹能力較強(qiáng)，復(fù)水較快。

圖3 細(xì)菌纖維素的溶脹率Fig. 3 Swelling rate of dried BC samples

未干燥（對(duì)照）和吸水后的細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)如圖4 所示。BC-FD80 和BC-FD20 吸水后能恢復(fù)一定厚度，形態(tài)與對(duì)照差別不大。BC-DD70 和BC-DD50 吸水后能恢復(fù)一點(diǎn)厚度，而BC-MVD 吸水后幾乎不能恢復(fù)厚度。其中，BC-DD70、BC-DD50和BC-MVD 內(nèi)部的纖維緊密排列，空洞的空間較小，容納較少的水分子；BC-FD20 和BC-FD80 內(nèi)部纖維松散，可容納大量水分子，也說(shuō)明其內(nèi)部纖維形成較少氫鍵，水分子易進(jìn)入纖維內(nèi)部，使BC-FD20和BC-FD80 吸水后幾乎恢復(fù)到?jīng)]被干燥的細(xì)菌纖維素的狀態(tài)，與馮勁等[2]的研究結(jié)果相一致。

圖4 細(xì)菌纖維素吸水后表觀效果Fig. 4 Morphology of rehydrated BC samples

2.3 不同干燥方式細(xì)菌纖維素的吸水速率和動(dòng)力學(xué)分析

細(xì)菌纖維素的復(fù)水溶脹是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，其吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程可以用公式（3）和（4）進(jìn)行描述[3]。

式中，Mt和Me是t時(shí)和吸水平衡時(shí)細(xì)菌纖維的質(zhì)量（g）；M0是細(xì)菌纖維素干樣品的質(zhì)量（g）；K是網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)，t是吸水時(shí)間；n是溶脹特征指數(shù)。n≤0.5，水的擴(kuò)散屬于Fickian 擴(kuò)散；0.5＜n＜1.0，水的擴(kuò)散屬于non-Fickian 擴(kuò)散；n≥1.0，水的擴(kuò)散屬于大分子鏈松弛擴(kuò)散。D是水在細(xì)菌纖維素中的擴(kuò)散系數(shù)；h是樣品的厚度。

不同干燥方式細(xì)菌纖維素的吸水溶脹過(guò)程的溶脹特征指數(shù)n如表2 所示。n值＜0.5，說(shuō)明水在細(xì)菌纖維素中的擴(kuò)散屬于Fickian 擴(kuò)散[3]，其擴(kuò)散行為通過(guò)公式（5）進(jìn)行考察，Qt與t0.5呈線性關(guān)系，如圖5所示。擬合直線的斜率k，根據(jù)公式（6）計(jì)算出水在細(xì)菌纖維素中的擴(kuò)散系數(shù)，如表3 所示，擴(kuò)散系數(shù)為BC-FD20＞BC-FD80＞BC-DD50＞BC-DD70＞BC-MVD，與復(fù)水性能結(jié)果一致，冷凍干燥方法優(yōu)于其他2 種干燥方法。

表2 不同干燥方式細(xì)菌纖維素的吸水溶脹過(guò)程的溶脹特征指數(shù)Table 2 Rehydration indices of BC samples dried by different methods

表3 不同干燥方式細(xì)菌纖維素的吸水溶脹過(guò)程的擴(kuò)散系數(shù)Table 3 Diffusion coefficients of dried BC samples upon rehydration

圖5 擬合的斜率Fig. 5 Water absorption rate after fitting

3 討論與結(jié)論

由細(xì)菌纖維素表面的微觀結(jié)構(gòu)分析可知，不同干燥方式使BC 的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異，其中真空冷凍干燥的樣品保持了原有的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。真空冷凍干燥中凍結(jié)過(guò)程是影響細(xì)菌纖維素形態(tài)的關(guān)鍵因素[18]。文中?20 ℃與?80 ℃的預(yù)凍結(jié)溫度相比，凍結(jié)速度較慢，BC 表面形成大塊的冰晶，體積增大擠壓BC 內(nèi)部的纖維，使BC 內(nèi)部的纖維排列更緊密。預(yù)冷溫度越低，可迅速將BC 的水凍結(jié)成小冰晶，對(duì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響小，這與馮勁等[2]的研究結(jié)果相一致，所以BC-FD80 能保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)，復(fù)水性能最好。熱風(fēng)干燥是BC 直接與熱空氣接觸，使BC 內(nèi)外產(chǎn)生濕分差，發(fā)生皺縮，纖維不斷堆積層疊，占據(jù)原始水所占的空隙[19]，所以使BC 的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本研究獲得BC-MVD 樣品的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞最大，可能與影響微波真空干燥效果的物料大小、微波功率、真空度和微波工作模式等因素有關(guān)[20]。李瑜等[21]研究結(jié)果表明微波真空干燥可以縮短大蒜的干燥時(shí)間，但干燥后的大蒜的質(zhì)構(gòu)緊密，不如冷凍干燥的疏松，這與本研究的結(jié)果冷凍干燥的細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)疏松相一致。

BC 的復(fù)水溶脹過(guò)程屬于Fickian 擴(kuò)散，與微觀結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。Wan 等[22]也證明了BC 復(fù)水溶脹過(guò)程屬于Fickian 擴(kuò)散。Hadi 等[23]研究表明BC 的脫水動(dòng)力學(xué)的主要機(jī)理是Fickian 擴(kuò)散定律。Pavaloiu 等[24]研究表明BC-明膠的溶脹機(jī)制也屬于Fickian 擴(kuò)散。BC 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響B(tài)C 的復(fù)水溶脹過(guò)程，BC 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保持越完整，材料的擴(kuò)散系數(shù)越高，對(duì)應(yīng)的復(fù)水性能越好[3]。真空冷凍干燥獲得的BC 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保持的最完整，所以獲得的BC 的復(fù)水性能最好，為細(xì)菌纖維素的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。在實(shí)際生產(chǎn)中，可選擇Fickian 擴(kuò)散定律來(lái)預(yù)測(cè)并控制細(xì)菌纖維素干燥過(guò)程的水分變化規(guī)律，為細(xì)菌纖維素干燥過(guò)程的節(jié)能降耗、設(shè)備選型和品質(zhì)提升提供理論支持。