沈植國，孫 萌，丁 鑫，程建明，陳迪新

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450008；3.河南科技大學(xué) 園藝與植物保護學(xué)院，河南 洛陽 471023)

蠟梅[Chimonanthuspraecox(L.) Link]是蠟梅科蠟梅屬落葉灌木，是中國傳統(tǒng)的名貴觀賞花木，有較高的觀賞價值、藥用價值，以及深刻的文化內(nèi)涵，有很強的開發(fā)推廣價值。近年來，關(guān)于蠟梅的研究很多，但主要集中在種質(zhì)資源調(diào)查[1]、藥效物質(zhì)和化學(xué)成分[2-3]、品種分類，以及品種、品系生物學(xué)特性等方面[4-7]。由于蠟梅花期的特殊性，加上花粉活力可能較低或是目前還未找到合適的培養(yǎng)基，花粉萌發(fā)率和花粉管生長情況都不理想；而且關(guān)于蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究報道較少[8]。蠟梅主要分為素心、喬種、紅心3大類型，關(guān)于3種類型花粉的全面系統(tǒng)研究尚未見報道，目前已有的研究結(jié)論僅局限于蠟梅物種，還沒有具體到某一個類型或品系[9-10]。已有研究表明，蠟梅同一朵花內(nèi)的雌雄蕊在時間和空間上有花期不遇的現(xiàn)象，其繁育系統(tǒng)為兼性異交型，有一定的自交比例，但需傳粉媒介[8]。因此，掌握不同品系蠟梅花粉的萌發(fā)和生長特性，為指導(dǎo)生產(chǎn)中合理配置授粉品種、促進蠟梅開花結(jié)實和品種選育有重要意義。由于我國不同品種、不同地域間蠟梅花期間隔多數(shù)為30 d左右，本研究以-20 ℃下貯藏30 d的素心、喬種、紅心3個類型5個品系的花粉為材料，采用能夠直觀、精確地反映花粉活力的離體萌發(fā)法[11-12]，系統(tǒng)研究不同培養(yǎng)基成分對不同類型蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響，旨在篩選出適宜不同類型蠟梅花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，為指導(dǎo)生產(chǎn)實踐中科學(xué)授粉和雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗所用的蠟梅花采于河南省許昌市魏都區(qū)。豫素1號、豫素2號品系為素心類型，豫喬1號、豫喬2號品系為喬種類型，豫紅1號品系為紅心類型?；ǚ凼占幚韰⒖紡埥B鈴等[12]的方法。

1.2 方法

前期試驗培養(yǎng)基成分統(tǒng)一為10 mg·L-1H3BO3+10 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O+250 g·L-1PEG-4000[13]。采用單因素試驗分別研究PEG-4000、蔗糖、H3BO3、Ca(NO3)2·4H2O對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，參照王友保等[14]的方法略作修改。試驗分別設(shè)置以下處理，以不加該物質(zhì)作為對照，PEG-4000的濃度分別為0、150、200、250、300 g·L-1，蔗糖的濃度分別為0%、2.5%、5%、7.5%、10%，H3BO3的濃度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1，Ca(NO3)2·4H2O的濃度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1。每個處理重復(fù)3次。

在上述試驗的基礎(chǔ)上，采取三因素五水平正交試驗，研究不同化合物共同作用對花粉活力的影響。試驗設(shè)計見表1。

試驗中將一片雙層濕濾紙放入培養(yǎng)皿中保濕，每6 h加1次蒸餾水，將凹槽載玻片放入培養(yǎng)皿中，然后將配好的培養(yǎng)液用膠頭滴管滴至載玻片凹槽處，從冰箱中取出花粉，然后用鑷子在硫酸紙上刮下少量花粉，將花粉抖在培養(yǎng)液上，蓋上培養(yǎng)皿，然后在15 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察。

1.3 花粉萌發(fā)率測定

花粉培養(yǎng)48 h后，將載玻片從培養(yǎng)箱中取出，在光學(xué)顯微鏡下觀察(NOVEL XS-212南京江南永新)?；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑(平均直徑為98.50 μm)視為萌發(fā)。在光學(xué)顯微鏡同一個視野中記錄萌發(fā)和未萌發(fā)的花粉數(shù)量，計算萌發(fā)率。每次處理重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察5個視野，每個視野觀察花粉粒不少于30個。

花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的花粉數(shù)÷總花粉數(shù)×100。

1.4 花粉管長度測量

取長勢清晰的萌發(fā)花粉在顯微鏡下觀察，用測微尺隨機測量花粉管長度。每個視野測量花粉管數(shù)量不少于30個，計算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Duncan新復(fù)極差法進行數(shù)據(jù)分析、方差分析和多重比較。所用數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS 20.0和Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

由圖1可知，當蔗糖濃度為0時，花粉萌發(fā)，花粉管生長正常；除豫喬1號(在濃度5%時萌發(fā)率達到最高，為18.94%)外，萌發(fā)率和花粉管長度均最大，豫素1號、豫素2號、豫喬2號、豫紅1號的萌發(fā)率分別為20.12%、19.58%、18.46%、18.57%；豫素1號、豫素2號、豫喬1號、豫喬2號、豫紅1號的花粉管長度分別為211.54、206.67、201.47、194.14、193.89 μm。隨著蔗糖濃度的升高，2個喬種蠟梅在蔗糖濃度5%時萌發(fā)率有所提升，其他3種蠟梅萌發(fā)率均呈下降趨勢，當蔗糖濃度高于5%時，5種蠟梅花粉萌發(fā)率均明顯下降；隨著蔗糖濃度的升高，5種蠟梅花粉管長度均逐漸變短。表明蔗糖在培養(yǎng)基中對臘梅花粉萌發(fā)不起決定性作用，高濃度蔗糖會抑制蠟梅花粉的萌發(fā)。

2.2 聚乙二醇(PEG-4000)對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

從圖2中可以看出，對照組中花粉均未萌發(fā)，說明PEG-4000是這5種蠟梅花粉離體培養(yǎng)所必需的培養(yǎng)基組分。隨著培養(yǎng)基中PEG-4000濃度的增加，5種花粉萌發(fā)率顯著升高，花粉管長度顯著增加，當PEG-4000濃度達到250 g·L-1時，5種蠟梅的萌發(fā)率均達到最大值，豫素1號、豫素2號、豫喬1號、豫喬2號、豫紅1號的花粉萌發(fā)率分別為32.01%、30.21%、27.31%、29.81%、27.59%；當PEG-4000濃度達到300 g·L-1時，這5種蠟梅的花粉萌發(fā)率分別下降至28.71%、28.57%、23.92%、29.62%和26.53%，說明高濃度PEG-4000對這5種蠟梅花粉萌發(fā)均有抑制作用。不同濃度PEG-4000對這5種蠟梅花粉管生長的影響和對花粉萌發(fā)的影響相似，當PEG-4000小于250 g·L-1時，花粉管長度隨著PEG-4000濃度的增加而增大，當PEG-4000為250 g·L-1時，豫素1號、豫素2號、豫喬1號、豫喬2號和豫紅1號的花粉管長度達到最大值，分別為272.18、268.81、279.21、250.34、230.86 μm，超過該濃度后，各蠟梅品系花粉管長度均下降。當PEG-4000為250 g·L-1時，花粉萌發(fā)率最高的品種為豫素1號，花粉管最長的品系卻為豫喬1號，其他濃度時這種差異有時也存在。綜上，PEG-4000為150～300 g·L-1時，可促進不同品系蠟梅花粉萌發(fā)，且在250 g·L-1時效果顯著好于其他濃度處理。

2.3 硼酸對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

由圖3可知，在一定濃度范圍內(nèi)，5個品系蠟梅花粉的萌發(fā)率和花粉管長度均隨著培養(yǎng)基硼酸濃度的升高而增加。當硼酸濃度為10 mg·L-1時，5個品系蠟梅花粉萌發(fā)率和花粉管長度均達到最大值，豫素1號、豫素2號、豫喬1號、豫喬2號和豫紅1號花粉萌發(fā)率分別為26.32%、25.94%、26.97%、26.47%、23.91%，分別是各自對照組的3.15倍、3.16倍、3.67倍、3.58倍和2.47倍；這5個品系的花粉管長度分別為238.96 μm、244.28 μm、233.14 μm、224.44 μm和259.65 μm，分別是各自對照組的1.56倍、1.69倍、1.69倍、1.67倍和1.87倍。當硼酸濃度高于10 mg·L-1時，5個品系的蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長受到明顯抑制但仍高于對照組。整體變化趨勢表明，低濃度促進作用大于高濃度的抑制作用，且不同品系的萌發(fā)率和花粉管長度受硼酸的影響程度不完全一致?？傮w上，一定濃度的硼酸(10 mg·L-1)能促進蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長。

2.4 硝酸鈣對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響

由圖4可知，5個品系蠟梅對鈣的反應(yīng)與硼酸一致，先隨著培養(yǎng)基內(nèi)硝酸鈣濃度的升高而增加；當硝酸鈣濃度為10 mg·L-1時，5個品系蠟梅花粉萌發(fā)率和花粉管長度達到最大值，豫素1號、豫素2號、豫喬1號、豫喬2號和豫紅1號花粉萌發(fā)率分別為26.57%、27.34%、23.45%、24.15%和24.86%，花粉管長度分別為224.33 μm、218.75 μm、199.77 μm、187.21 μm和209.65 μm；當硝酸鈣濃度高于15 mg·L-1時，蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管長度受到抑制，但大部分仍高于對照組(豫喬2號除外)。不同濃度對比，可以看出不同品系均表現(xiàn)為高濃度抑制作用較低濃度促進作用小。說明一定濃度的硝酸鈣(10 mg·L-1)能促進蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長，濃度過高反而抑制蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長。

2.5 最佳培養(yǎng)基成分選擇

通過單因子試驗可以看出，PEG-4000、硼酸、硝酸鈣這3種物質(zhì)都能在不同程度上促進蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管的生長，而添加蔗糖卻不利于花粉管生長。在正交試驗中只考慮對花粉萌發(fā)有利的因素，目的是找出硼酸、硝酸鈣、PEG-4000的最佳組合來配置培養(yǎng)基。由表1可知，當PEG-4000為250 g·L-1，硝酸鈣濃度為10 mg·L-1，硼酸濃度為20 mg·L-1時，豫素1號、豫素2號和豫紅1號花粉萌發(fā)率最高，分別為25.38%、25.34%和23.46%；此時它們的花粉管長度最長，分別達到302.31 μm、297.64 μm和285.68 μm。因此，素心和紅心類蠟梅花粉最佳培養(yǎng)基的組成為：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸鈣 10 mg·L-1+硼酸20 mg·L-1。此時，PEG-4000和硝酸鈣濃度也是單因素試驗中的最佳濃度，但硼酸濃度卻高于單因素試驗的濃度。

表1 正交試驗中各組合蠟梅的花粉萌發(fā)率和花粉管長度Table 1 Pollen germination rate and pollen tube length of different Chimonanthus praecox strains in different combination in orthogonal test

續(xù)表1 Continued Table 1

當PEG-4000濃度為250 g·L-1，硝酸鈣濃度為5 mg·L-1，硼酸濃度為15 mg·L-1時，豫喬1號和豫喬2號花粉萌發(fā)率最高，達到了24.43%和24.93%，花粉管長度最長，達到了288.27 μm和286.37 μm。因此，喬種蠟梅最佳培養(yǎng)基的組成為：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸鈣5 mg·L-1+硼酸15 mg·L-1。此時，PEG-4000也是單因素試驗中的最佳濃度，硼酸濃度高于單因素試驗的最佳濃度，而硝酸鈣濃度卻低于單因素試驗的最佳濃度。

由表2方差分析結(jié)果可知，PEG-4000對蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管長度影響比較大，不同濃度之間差異顯著，硼酸和硝酸鈣的影響比PEG-4000小，不同濃度之間差異不顯著。

表2 正交試驗中PEG、H3BO3、Ca(NO3)2處理經(jīng)SPSS軟件主效應(yīng)分析的均方(MS)、F值與R2Table 2 Mean square (MS)，F(xiàn) value and R2 of PEG，H3BO3 and Ca (NO3)2 in orthogonal test by SPSS software

3 結(jié)論與討論

本研究表明，PEG-4000是蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長的必需成分，硼酸和硝酸鈣對其影響較PEG-4000小，但也有一定的輔助作用，一定濃度的蔗糖會抑制蠟梅花粉萌發(fā)和花粉管生長。素心和紅心類蠟梅花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為PEG-4000 250 g·L-1+硝酸鈣10 mg·L-1+硼酸20 mg·L-1。喬種蠟梅花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基的配方為：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸鈣5 mg·L-1+硼酸15 mg·L-1。素心類型蠟梅的花粉萌發(fā)和生長情況較好，更適宜作為授粉用花粉。

花粉中以淀粉為主的內(nèi)源性糖能夠為花粉萌發(fā)提供能量來源，外源性糖比內(nèi)源性糖的作用顯著[11]。研究表明，蔗糖是很多植物花粉離體萌發(fā)和生長所必需的營養(yǎng)成分[10，15-17]。但在本試驗中，添加蔗糖時，花粉萌發(fā)和花粉管生長受到明顯抑制，且濃度越高，花粉萌發(fā)和生長所受到的抑制作用越明顯，不添加蔗糖的培養(yǎng)基反而更適合蠟梅花粉的萌發(fā)和花粉管伸長，這與龔雙姣等[10]和趙宏波等[18]的研究結(jié)果一致，但與郭娟等[17]和胡珂雪等[19]的研究結(jié)果相反。這可能與物種有一定的關(guān)系，研究結(jié)果與本文一致的都是蠟梅，而研究結(jié)果與本文相反的分別為冬青屬植物和四季報春。

在本研究中，5個品系蠟梅花粉在沒有PEG-4000的培養(yǎng)基上均不萌發(fā)，當添加一定量的PEG-4000后，花粉萌發(fā)率逐漸升高，花粉管長度逐漸變長，表明PEG-4000對素心、喬種和紅心3種類型蠟梅的花粉萌發(fā)和花粉管伸長有促進作用，這與龔雙姣等[10]、趙宏波等[18]、王四清等[20]的研究結(jié)果一致。郭娟等[17]、胡珂雪等[19]在沒有使用PEG時，花粉也能夠萌發(fā)和生長，這個可能與物種或該物種本身含有特殊功能物質(zhì)有關(guān)，值得進一步探討。

硼酸主要參與花粉管頂端細胞壁的構(gòu)建，影響花粉管的生長，鈣離子使花粉管壁的可塑性降低，且具有相當硬度[17，20]。大多數(shù)植物花粉萌發(fā)需要額外添加一定量的鈣，除非大量花粉聚集在一起而產(chǎn)生群體效應(yīng)。一般情況下，花粉自身所含的硼離子和鈣離子是不足的，需要在培養(yǎng)基中添加一定量的硼和鈣來促進花粉的萌發(fā)和生長，不同種類植物花粉萌發(fā)和生長所需的硼和鈣濃度存在一定的差異[21-24]，種內(nèi)或品系間差異一般較小。正交試驗中，5個品系蠟梅花粉在相同條件下所受硼酸和硝酸鈣的影響無明顯差異，但物種間有差異。相對于大花蕙蘭，蠟梅品系花粉萌發(fā)所需鈣濃度較低，而所需硼酸濃度無差異；相對于獼猴桃，蠟梅品系花粉萌發(fā)所需硼酸濃度較低，但所需鈣濃度無差異[25-26]，具體原因有待進一步探討。