梁碩，孫宇婷，王萍，趙大鵬，2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)目前在我國為多發(fā)性常見疾病之一，其臨床發(fā)病率在近年來、世界各國范圍內(nèi)，逐年呈上升趨勢。而隨著病情病程的發(fā)展，大多數(shù)患者也可因此而導致微血管的局部病變。DM的誘因大多與其遺傳因素與環(huán)境因素有關，大量患者在上述因素長期作用下可引發(fā)病變，多表現(xiàn)為累及腎臟。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM最常見的慢性微血管并發(fā)癥，病情的不同程度均對患者日常工作與生活造成較大影響，在身體、心理、經(jīng)濟上都體現(xiàn)出來[1-3]。隨著病情的逐漸加重，發(fā)展至終末期腎病(ESRD)。

對DN患者進行早期防治，延緩其進展，已成為現(xiàn)今醫(yī)療界共識。DN患者腎臟結(jié)構(gòu)的改變主要包括細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)的聚積、小球細胞的肥大和腎小膜的擴張，上述皆為評價腎小球硬化纖維化的重要指標。且ECM的合成與降解紊亂是導致腎小球硬化、纖維化的主要原因，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase，MMPs)是ECM代謝過程中的關鍵酶之一，其中MMP-9是ECM降解過程中最關鍵的酶之一。屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMPs)是一組能抑制MMPs活性的多功能因子。研究表明,在DN的發(fā)生和發(fā)展過程中, ECM在腎小球系膜區(qū)合成分泌的增加或降解的減少主要依賴于MMPs和TIMPs之間的分泌平衡。經(jīng)體外研究表明，MMP-9 基因多態(tài)性、MMP-9/TIMP-1表達的失衡及活性的改變與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-6]。

洋參御唐方以健脾補腎、益氣養(yǎng)陰為治療法則[7]。經(jīng)前期臨床研究表明，洋參御唐方對DN療效較好，可緩解糖尿病腎病患者的一般狀態(tài)、明顯改善相關指標，減輕患者焦慮和病痛，其機制主要為保護腎臟的功能，從而延緩DN病情病程的進展。本研究在以往臨床與實驗研究的基礎上，選取HMC為研究對象,觀察高糖培養(yǎng)下HMC的增殖，對MMP-9、TIMP-1表達影響，并用洋參御唐方藥物血清進行干預，觀察洋參御唐方對高糖培養(yǎng)下HMC的影響,并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑

洋參御唐方：黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所藥物制劑室生產(chǎn)。組成：西洋參、黃芪、麥冬、山茱萸、龜板、女貞子、山藥、白芍、鹿茸等。鹽酸貝那普利(洛汀新)：北京諾華制藥有限公司(生產(chǎn)批號：國藥準字H20030514，規(guī)格：10 mg/片)。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyCLone公司)；MTT(美國HyCLone公司);PBS(美國HyCLone公司);胎牛血清(美國HyCLone公司)；二甲基亞楓DMSO(美國Sigma公司)；青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；EDTA (美國Sigma公司)；D-葡萄糖干粉(北京寶希迪科技有限公司)；多聚甲醛(美國zymed公司);胰蛋白酶(美國HyCLone公司)。

1.2 實驗儀器

Multiskan354型酶標儀( Perkin Elmer公司VICTOR×3型),CO2恒溫培養(yǎng)箱(賽默飛公司,型號：3111)，MR18.12高速冷凍離心機(大連美侖生物技術有限公司)，細胞計數(shù)板(上海巴疚實業(yè)有限公司)，實時熒光定量PCR儀(MJ，Mini-Opticon2)。

1.3 實驗動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠60只，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，動物合格證號：SCXK(黑)2013-002。由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗室溫度22～25 ℃，相對濕度40%～75%。

2 實驗方法

2.1 含藥大鼠血清的制備

將60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，依體質(zhì)量進行編號，按“隨機數(shù)字表法”分成6組，每組10只。分別為對照組、洋參御唐方(高、中、低)劑量組、高糖組、貝那普利組。依據(jù)人與大鼠給藥劑量比例進行等效轉(zhuǎn)換,分別按2.7 g/(kg·d)給予洋參御唐方高劑量組大鼠,按1.35g/(kg·d)給予洋參御唐方中劑量組大鼠,按0.67 g/(kg·d)給予洋參御唐方低劑量組大鼠，按0.9 mg/(kg·d)給予貝那普利組大鼠分別進行對應藥物的灌胃給藥，對照組予以等體積的生理鹽水灌胃，每天1次，共7 d，飲食均正常。實驗末次給藥2 h后在離心管中加入抗凝劑，待大鼠行眼球取血后混勻，室溫4 ℃靜置化，3 000 r/min離心10 min，同組血清互相混勻，經(jīng)56 ℃ 30 min滅活補體，0.22 μm無菌過濾除菌，分裝于-80 ℃凍存。

2.2 細胞的培養(yǎng)

人腎小球系膜細胞惠贈于黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗室；HMC細胞復蘇后將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱環(huán)境設置為37 ℃、5%CO2，利用倒置顯微鏡觀察到細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，加適量PBS緩沖液洗凈細胞，棄去未貼壁細胞，吸除PBS，加入2 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞生長狀態(tài)良好。每隔1～2 d換新鮮培養(yǎng)基1次，待細胞生長至80%～90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。選取4～8代細胞進行實驗。

2.3 實驗分組及給藥

實驗分為6組：對照組，洋參御唐方高、中、低劑量組，高糖組，貝那普利組。對照組給予10%大鼠血清+RPMI-1640培養(yǎng)液,其余5組給予對應組別10%大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液。

2.4 MTT法檢測洋參御唐方對高糖培養(yǎng)下HMC増殖的影響

取健康對數(shù)生長期的貼壁人腎小球系膜細胞，經(jīng)過蛋胰白酶消化后用無菌膠頭滴管吹打細胞，并制備成單細胞懸液，經(jīng)細施計數(shù)板計數(shù)處理，配成密度為4×104cell/mL。均勻接種于96孔板中。每孔加培養(yǎng)液200 μL，并用等體積的PBS將細胞周圍的孔填充。將培養(yǎng)板置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合，換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞處于G0期，將其分為6組，依次加對應的對照、含藥血清、高糖培養(yǎng)液，接連培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，避光條件下每孔加15 μLMTT溶液，置培養(yǎng)箱孵育4 h。孵育停止后，棄上清液，分別加入150 μLDMSO溶液，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)儀測定光吸收值即A值，選擇測定波長490 nm，記錄結(jié)果。并繪制細胞的生長曲線。重復實驗3次。

2.5 Real-time法檢測各種處理因素對HMC中TIMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平的影響

2.5.1 細胞RNA的提取

取對數(shù)生長期的HMC細胞，含10%FBS RPML-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞至細胞貼壁，待細胞達80%融合，換為無血清培養(yǎng)液，同步細胞24 h，分別加入對應培養(yǎng)液(具體分組與給藥處理方法同上)。于48 h、72 h培養(yǎng)后，棄上清，加PBS緩沖液，清洗3遍，棄除吸干。將各培養(yǎng)瓶中加入1 mL Trizol Reagent的細胞裂解溶液中加入200 μL氯仿，蓋嚴管蓋，充分混勻。待溶液呈乳白狀充分乳化后，靜置其5 min。13 000 rpm 4 ℃離心10 min。將約600 μL上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中。在取出的上清液中加入600 μL異丙醇，將離心管中液體充分混勻后于-20 ℃放置10 min。在13 000 rpm 4 ℃離心10 min。棄去上清液，倒入75%乙醇1 mL洗滌離心管的管壁。4 ℃ 13 000 rpm/min離心5 min，棄上清液。室溫干燥5～15 min，加入100 μL RNase Free H2O吹打用以RNA的助溶。

2.5.2 RNA濃度測定及純度測定

總RNA的提?。豪酶呒兛俁NA快速提取試劑盒(北京百泰克生物)提取樣本總RNA。將樣本中加入1 mL RL裂解液，充分混勻，室溫下放置5 min。加200 μL氯仿，蓋嚴管蓋，充分混勻，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，RNA主要存在于溶液最下層的水相中，水相體積約為所用裂解液50%。將水相移至新管，緩慢加同體積70%乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱RA中，4 ℃、12 000 rpm離心30 s，棄去廢液。加入500 μL去蛋白液RE，4 ℃、12 000 rpm離心30 s，棄廢液。再加入500 μL漂洗液RW，靜置2 min，4 ℃、12 000 rpm離心30 s，棄殘液。將吸附柱放入1.5 mL收集管，4 ℃、12 000 rpm離心2 min，棄殘液。將吸附柱RA轉(zhuǎn)入新管，加30 μL RNase-free ddH2O，放置2 min，4 ℃、12 000 rpm離心2 min，即得到樣本總RNA。

2.5.3 RNA反轉(zhuǎn)錄

將得到的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄，對上步實驗所得的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄以得到對應的cDNA。反應體系如下：將1 μg總RNA、1 μL random引物、1 μL oligo(dT)15、2 μL dNTP(2.5 mM)加入至PCR薄壁管中，加DEPC水至總反應體系為14.5 μL。70 ℃加熱5 min后速冷2 min，離心收集反應液稍離心，65 ℃孵育5 min，取出冰水浴，稍離心，按順序分別加入4 μL 5×reaction buffer、0.5 μL RNasin、1 μL M-MLV(200 U)，總體積為20 μL混勻。用移液器混勻后25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min。95 ℃加熱5 min終止反應，冷凍保存。

2.5.4 Real-time PCR目的片段擴増的反應

引物合成：MMP-9、TIMP-1及GAPDH的引物各一對，由上海生工合成。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.6 統(tǒng)計學方法

3 實驗結(jié)果

3.1 葡萄糖對HMC增殖的影響

由表2可見，與對照組比較,高糖(30 mmol/L)環(huán)境對人腎小球系膜細胞在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h三個時段對系膜細胞刺激后均有增殖效應,差異有統(tǒng)計學意義。且細胞增殖作用最明顯為48 h后，作用時間延長到72 h呈下降趨勢。

表2 葡萄糖對不同時間點HMC增殖的影響

3.2 不同處理因素對HMC增值的影響

見表3。MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖(30 mmol/L)能顯著促進人腎小球系膜細胞(HMC)的增殖(24、48和72 h，P<0.01)。低劑量洋參御唐方(72 h，P<0.05)、中劑量洋參御唐方(48和72 h，P<0.01)和高劑量洋參御唐方(24、48和72 h，P<0.01)處理后，明顯抑制高糖對HMC的促增殖作用，差異具有統(tǒng)計學意義。而且，貝那普利處理后也能顯著抑制HMC的增殖(48和72 h，P<0.01)。洋參御唐方對高糖刺激下HMC增殖具有明顯抑制作用，呈一定劑量依賴性(與對照組相比，P<0.01；與高糖組相比，P<0.05或P<0.01)。

表3 不同處理因素對HMC增殖的影響

見表4、5。Real-time PCR結(jié)果顯示，對照組細胞存在一定水平MMP-9和TIMP-1 mRNA的本底表達。與對照組相比，高糖刺激能下調(diào)MMP-9 mRNA表達，并上調(diào)TIMP-1 mRNA表達(P<0.01)。與高糖組相比，中、高劑量洋參御唐方和貝那普利處理后，都能顯著上調(diào)MMP-9 mRNA的表達，并下調(diào)TIMP-1 mRNA表達(中劑量組，P<0.05；高劑量組，P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義(與對照組相比，P<0.01；與高糖組相比，P<0.05和P<0.01)。

表4 各組MMP-9 mRNA表達相對值比較

表5 各組TIMP-1 mRNA表達相對值比較

4 討論

糖尿病腎病是由糖尿病發(fā)展而來，因消渴是以陰虛內(nèi)熱為主要病機，兼有瘀血阻絡，主要病變臟腑在肺，脾，腎三臟，纏綿不愈則導致腎陽衰敗，陽不化氣，水濕內(nèi)停，從而膀胱氣化不利，小便洪濁[8]。古代醫(yī)學認為此病成因與身體因素關系密切，如《靈樞·五變篇》說“五臟皆柔弱者，善病消癉”[9]。因此當糖尿病累及腎臟損害的階段多屬中醫(yī)病證中的陰陽兩虛證[10]，即消腎是消渴的進一步加重。腎精虧虛，抑或腎元不足，下元虛冷氣化不能，則致陰精不能榮于上而發(fā)為口消；腎氣不固，致精微走泄則發(fā)為下消。故現(xiàn)代認為脾腎虧虛為DN發(fā)生發(fā)展的病機關鍵，且尤以腎虛為著。根據(jù)以上表述，洋參御唐方根據(jù)古今醫(yī)學對DN病機的認識行健脾補腎、益氣養(yǎng)陰之效，標本同治，補瀉兼施[11]。本方西洋參具健脾補腎，益氣養(yǎng)陰之效；黃芪重補氣生陽，益氣固表。二藥合用，補虛損、扶正氣；山藥增補脾養(yǎng)肺益腎之功；龜甲重滋陰潛陽[12]；玉竹、麥冬、烏梅增養(yǎng)陰、益胃、生津之功；女貞子可清虛熱；山茱萸收斂固澀；白芍斂陰；加鹿茸補陽調(diào)沖任[13]。本方在前期臨床治療糖尿病腎病過程中已顯示出較好的減少蛋白尿的療效，具有獨特的優(yōu)勢。因此本實驗研究欲借助觀察DN大鼠一般情況、生化指標、病理學改變及細胞因子等的改變來探討洋參御唐方治療DN的機理。

大量研究顯示，腎小球系膜細胞在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具有產(chǎn)生細胞因子、吞噬清除大分子物質(zhì)、分泌腎素的作用，系膜細胞的增殖與細胞外基質(zhì)的堆積是腎小球硬化的關鍵機制，如SLN、IgAN、感染后腎炎等疾病發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用。系膜細胞在病理情況下可通過自分泌或旁分泌形式來釋放多種細胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子、生長激素(GF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和表皮生長因子(EGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等[14]，造成ECM產(chǎn)生增加，從而促進腎臟疾病的進一步發(fā)展，加重腎小球的損害，晚期則出現(xiàn)腎小球硬化,最終引起腎功能衰竭[15]。

腎小球系膜細胞是腎臟纖維化的主要效應細胞,MC的異常增殖是腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)[16]。MC的異常增殖及炎癥介質(zhì)的釋放導致了ECM的積聚，這一機制是DN進展的關鍵。高血糖是引起糖尿病患者及糖尿病動物模型的腎小球系膜細胞異常增殖的最初因素,在高糖環(huán)境中一些細胞因子及TGF-β都參與了對MC的增殖作用。研究發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)的HMC與DN大鼠的腎小球系膜細胞在病理改變上存在著相同的過程[17]。根據(jù)MTT結(jié)果看，與對照組相較，高糖組細胞生長活躍，這可能與高糖環(huán)境刺激HMC增殖與激活細胞內(nèi)某些基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的表達有關。給藥組(洋參御唐方高、中、低劑量組及貝那普利組)對高糖培養(yǎng)下的HMC增殖均有抑制作用。通過上面實驗可得，洋參御唐方能夠在DN發(fā)生發(fā)展過程中減少ECM的積聚，防治蛋白尿，延緩腎小球硬化都具有重要意義，且對高糖培養(yǎng)下HMC增殖均有抑制作用，且從觀察時間與給藥組不同劑量發(fā)現(xiàn)，洋參御唐方對HMC的增殖抑制作用呈時間依賴性與濃度依賴性關系。高糖環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細胞中MMP-9表達增加,TIMP-1表達減少。

近年來研究表明，MMP-9的主要功能是參與ECM的降解與重建，可切斷任何ECM的成分，是ECM降解過程中最關鍵的酶之一。當受到某種刺激因子導致體內(nèi)ECM產(chǎn)生過多時，也誘導了MMP-9的表達增加?，F(xiàn)今研究報道，檢測尿液中MMP-9及IV型膠原的含量可能對評估2型糖尿病患者,特別是患者處于早期腎損害的程度起作用。在正常生理情況下,尿液中的明膠酶主要是MMP-9,而當2型糖尿病患者出現(xiàn)蛋白尿時,其尿液中的MMP-9的含量均顯著增加[5]。TIMPs主要功能是對MMPs活性的抑制,通過抑制MMPs的活性來調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝；此外在細胞生長及繁殖、血管生成等生理和病理學方面發(fā)揮一定的作用。TIMPs對MMPs活性的抑制不僅存在一定的交叉性，而且存在特定的選擇性，在調(diào)節(jié)ECM的代謝中起重要的作用[18]。MMP-9是TIMP-1的作用底物之一，因此TIMP-1在DN的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Phillips[19]等研究發(fā)現(xiàn), HMC在高糖環(huán)境下培養(yǎng)24 h后, TIMP-1的水平比對照組增加了8倍。在高糖環(huán)境下既能使HMC的TIMP-1的mRNA表達增加2.1倍,使ECM降解減少[20]。上述表明，高糖既能使TIMP-1的表達增加, MMP-9的表達下調(diào)，MMP-9活性受到抑制,MMP-9/TIMP-1的失衡導致了ECM降解的減少，也加劇了DN的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本實驗研究說明洋參御唐方都能夠抑制HMC的增殖，減少ECM積聚，使MMP-9 mRNA的表達上調(diào)，且以洋參御唐方高劑量組的作用最明顯，具有延緩腎小球硬化進展的作用。在高糖環(huán)境下HMC中TIMP-1 mRNA的表達增加，而洋參御唐方和貝那普利組的TIMP-1 mRNA表達均受到抑制，且以洋參御唐方高劑量組對TIMP-1 mRNA表達抑制作用更為明顯，能降低TIMP-1，調(diào)控降解酶系 MMP-9/TIMP-1 比例，抑制 DN 細胞外基質(zhì)沉積。