曲 帥，闞 鴻，李金花，丁 茹，趙麗茹

（1.吉林省生物研究所藥用真菌研究室，長(zhǎng)春 130012；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；3.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550014）

甘草附子湯源于張仲景的《傷寒論》，由甘草、黑順片、白術(shù)、桂枝四味中藥材組成，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、溫陽(yáng)補(bǔ)中的功效，在臨床上應(yīng)用廣泛，主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。文獻(xiàn)報(bào)道[1]表明，甘草附子湯能夠通過(guò)下調(diào)去卵巢磁性大鼠的破骨細(xì)胞CathK的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞ColI蛋白的降解，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定的治療作用。目前對(duì)甘草附子湯的藥理學(xué)研究主要集中在利用佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型來(lái)研究其抗炎機(jī)制[2-3]，但是尚無(wú)對(duì)其急性炎癥作用機(jī)制的研究。炎癥模型中，角叉菜膠誘導(dǎo)的急性胸膜炎是經(jīng)典的急性炎癥模型，因其對(duì)藥物敏感且重現(xiàn)性較好，因此廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的篩選和評(píng)價(jià)中[4-5]。本研究觀察甘草附子湯對(duì)急性胸膜炎模型大鼠的抗炎作用，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)的炎癥介質(zhì)，初步探討甘草附子湯對(duì)急性炎癥的作用機(jī)理，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物與試劑 實(shí)驗(yàn)所用中藥材甘草、黑順片、白術(shù)、桂枝均購(gòu)自長(zhǎng)春福百草大藥房。甘草附子湯的制備以甘草:黑順片:白術(shù):桂枝按照1:2:1:2的比例，分別采用10倍蒸餾水和8倍蒸餾水進(jìn)行回流提取，合并2次提取液后，減壓濃縮成浸膏。灌胃給藥時(shí)，以不同體積蒸餾水分別制備成不同濃度藥液。角叉菜膠，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，一氧化氮（NO）含量測(cè)定試劑盒，大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，南京建成生物工程研究所。醋酸地塞米松片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3儀器 酶標(biāo)分析儀（DNM-9602），北京普朗新技術(shù)有限公司；凱特TG16B臺(tái)式高速離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模及給藥 將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型組、醋酸地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、甘草附子湯高、中、低劑量組，每組10只。醋酸地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組（3mg·kg-1），甘草附子湯高、中、低劑量組（13.2、6.6、3.3g·kg-1生藥）分別灌胃相應(yīng)濃度藥物，連續(xù)灌胃7d，每天1次，正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。第7天于末次給藥30min后，模型組及各給藥組動(dòng)物分別用乙醚輕度麻醉，仰臥位固定，剪去右側(cè)肋上毛，用酒精消毒皮膚。在右上肢下第7、第8肋骨間皮膚用剪刀剪一小切口，暴露肋間肌肉，在肌肉切口處向右胸膜腔內(nèi)注入1%角叉菜膠（2mL·kg-1），正常對(duì)照組注入等體積生理鹽水，注射部位在左胸腔第6、第7助骨間，靠近鎖骨中線處。扎針時(shí)扎破后阻力消失時(shí)，立即停止，需快速進(jìn)行，以免損傷肺臟[6-7]。致炎4h后各組動(dòng)物再灌胃給藥或生理鹽水1次。

1.2.2標(biāo)本采集與檢測(cè) 致炎8h后處死動(dòng)物，剪開(kāi)腹部皮膚暴露膈肌，用2mL生理鹽水分3次從胸腔最上部沖洗，吸取胸腔兩側(cè)所有的胸腔積液，量取其體積并觀察胸液的顏色狀態(tài)。大鼠胸腔積液的體積由量取的體積減去沖洗的生理鹽水計(jì)算而得。2000r·min-1離心10min，取上清液分別測(cè)定MDA、NO、SOD含量。沉淀物以生理鹽水稀釋，混勻進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。將胸膜炎模型大鼠中所取得的血清分離后，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA、NO、SOD、IL-1β及TNF-a含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草附子湯對(duì)急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液與白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

見(jiàn)表1。

表1 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠胸腔滲出液體積與白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（±s，n= 10）

表1 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠胸腔滲出液體積與白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） 滲出量/mL-1 WBC/（×109·L-1）正常對(duì)照組 0.15±0.04 1.59±0.63模型組 0.96±0.16## 11.23±2.76##地塞米松組 0.003 0.24±0.09△△ 2.53±0.60△△甘草附子湯組3.3 0.56±0.21△△ 6.23±2.19△△6.6 0.48±0.14△△ 5.56±3.33△△13.2 0.34±0.14△△ 4.39±2.08△△

2.2 甘草附子湯對(duì)急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD 含量的影響

見(jiàn)表2。

表2 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD的影響（±s，n= 10）

表2 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠胸腔滲出液中MDA、NO、SOD的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常對(duì)照組 — 6.20±1.30 5.34±1.23 90.72±3.33模型組 — 15.68±2.45## 23.35±5.16## 45.80±3.79##地塞米松組 0.003 10.74±2.46△△ 7.83±3.76△△ 79.04±3.12△△甘草附子湯組3.3 13.63±2.69 18.18±4.56△ 55.80±1.94△△6.6 13.16±2.60△ 16.57±4.98△△ 68.34±3.43△△13.2 12.17±2.81△△ 12.61±4.37△△ 81.52±5.50△△

2.3 甘草附子湯對(duì)急性胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD 含量的影響

見(jiàn)表3。

表3 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影響（±s，n= 10）

表3 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影響（±s，n= 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常對(duì)照組 — 7.49±1.10 14.53±3.19 103.99±2.63模型組 — 13.47±3.24## 23.15±3.81## 71.63±4.95##地塞米松組 0.003 8.22±2.10△△ 16.46±2.78△△ 90.37±2.96△△甘草附子湯組3.3 11.58±3.32 19.18±2.58△△ 78.52±3.00△△6.6 10.82±3.35 18.16±2.85△△ 79.61±2.83△△13.2 9.83±2.78△ 17.34±2.28△△ 89.03±3.88△△

2.4 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響

見(jiàn)表4。

表4 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響（±s，n= 10） （pmol·L-1）

表4 甘草附子湯對(duì)胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影響（±s，n= 10） （pmol·L-1）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1生藥） TNF-α IL-1β正常對(duì)照組 — 168.43±25.37 85.18±16.38模型組 — 260.78±34.75## 153.83±31.17##地塞米松組 0.003 189.62±31.77△△ 102.37±27.18△△甘草附子湯組3.3 230.88±43.00 157.66±35.70 6.6 246.92±53.96 145.62±24.39 13.2 221.05±25.13△△ 126.09±23.86△

3 討論

研究[8]表明，炎癥的發(fā)生和發(fā)展與自由基的損傷密切相關(guān)，氧自由基可與不飽和脂肪酸生成過(guò)氧化脂質(zhì)，過(guò)氧化脂質(zhì)可進(jìn)一步分解為MDA等，因此MDA的含量可評(píng)價(jià)機(jī)體被脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草附子湯高劑量組可抑制大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中的MDA，甘草附子湯低劑量組對(duì)其抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示甘草附子湯的抗炎作用可能與抗氧化作用有關(guān)系，并且與劑量相關(guān)。SOD可在體內(nèi)清除超氧陰離子，它的活性高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，即機(jī)體的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量的甘草附子湯可通過(guò)提高大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中的SOD活性，提高機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)而起到抗炎的作用。

NO可在炎癥反應(yīng)的許多環(huán)節(jié)中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，炎癥發(fā)生時(shí)，致炎物或炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)或增加局部NO的合成和釋放，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)如血管擴(kuò)張充血、水腫等。通過(guò)檢測(cè)NO的含量，我們發(fā)現(xiàn)，甘草附子湯中、高劑量組均可顯著降低大鼠胸膜炎模型胸腔組織液和血液中NO的含量，因此表明甘草附子湯可通過(guò)降低NO的水平對(duì)炎癥起到一定的抑制作用。

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附、滲透，從而導(dǎo)致局部炎癥，是一種重要的促炎性因子和免疫調(diào)節(jié)因子，是調(diào)節(jié)炎癥的使動(dòng)因素，可引起細(xì)胞死亡和組織損傷，參與人體多種急、慢性炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。IL-1也是參與炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一，可以通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞COX-2基因的表達(dá)，使前列腺素的分泌增加而參與介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)；增加合成趨化因子，促進(jìn)大鼠體內(nèi)多形核白細(xì)胞向局部炎癥部位聚集[12]；還能誘導(dǎo)出與TNF-α相似的生理和代謝改變，并與TNF-α產(chǎn)生相互協(xié)同作用，TNF-α還可以激發(fā)血管內(nèi)皮因子釋放，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的合成，并表達(dá)IL-1β，同時(shí)IL-1β可以作用于TNF-α，加重TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害作用，促進(jìn)炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)聚集[13-15]。IL-1還可以直接作用于下丘腦發(fā)熱中樞引起發(fā)熱，刺激肝細(xì)胞分泌急性期蛋白，從而表現(xiàn)出急性炎癥的特征[16]。IL-β在中性粒細(xì)胞趨化、激活過(guò)程中起重要作用，是調(diào)節(jié)炎癥的始動(dòng)因素和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，主要存在于關(guān)節(jié)內(nèi)，因此研究甘草附子湯對(duì)大鼠IL-β的調(diào)節(jié)作用，對(duì)闡明其治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病機(jī)理有重要提示作用[11]。此外，研究[17]表明TNF-α、IL-1β在胸膜炎炎癥調(diào)節(jié)中可發(fā)揮重要作用。甘草附子湯高劑量組可降低胸膜炎模型大鼠血液中IL-1β和TNF-α的含量，尤其可顯著降低TNF-α的合成和分泌，提示甘草附子湯的抗急性炎癥機(jī)理可能與抑制這2種炎癥因子的作用達(dá)到抗炎的效果相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明，甘草附子湯對(duì)急性炎癥胸膜炎具有較好的抑制作用，尤其是高劑量組效果顯著，其抗炎作用機(jī)理可能與甘草附子湯具有抗氧化成分，能夠提高SOD的活性，減少M(fèi)DA的生成以及能夠抑制NO、TNF-α、IL-1β炎性介質(zhì)的釋放有關(guān)。本研究可為開(kāi)發(fā)拓展甘草附子湯的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，但是由于炎癥是一個(gè)比較復(fù)雜的病理過(guò)程，受到機(jī)體多因素的影響，因此需要進(jìn)一步從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、毒理學(xué)等多方面多角度進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制。