李建華，趙良友，張 娜，劉成臻，劉樹(shù)民

（1.中國(guó)輻射防護(hù)研究院，太原 030000，2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

白樺茸（Betulaplatyphylla），屬于多孔菌科纖孔菌屬，菌核呈現(xiàn)瘤狀，外表黑灰，有不規(guī)則溝痕，內(nèi)部黃色，較硬。研究[1]表明，白樺茸在癌癥、糖尿病、心臟病和胃腸道疾病等方面有很好的療效。白樺茸主要活性物質(zhì)包括白樺茸多糖、白樺茸黃酮、白樺茸三萜類(lèi)物質(zhì)等[2]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)白樺茸水提物、白樺茸發(fā)酵液、白樺茸醇提物進(jìn)行小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定白樺茸醇提物對(duì)小鼠的LD50，為白樺茸保健品的研發(fā)及臨床使用提供可靠的保證。

1 材料與方法

1.1 藥材

大興安嶺白樺茸（Betulaplatyphylla）購(gòu)自黑龍江省藥材公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開(kāi)發(fā)教研室王振月教授鑒定為真菌門(mén)擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱非褐菌目多孔菌科褐臥孔菌屬白樺茸。

1.2 動(dòng)物

18～22gSPF級(jí)ICR小鼠140只，雌雄各半，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2018-003，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.3 試劑、儀器與設(shè)備

甲醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），甲醛（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水乙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），95%乙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），伊紅（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），蘇木素（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），二甲苯（天津市天力士化學(xué)試劑有限公司）。凍干機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），脫水機(jī)（LEICA-ASP300S），包 埋 機(jī)（LEICA-EG1150H），切 片 機(jī)（LEICARM2255），染色機(jī)（LEICA-ST5010），生物顯微鏡（OLYMPUS-CX31）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1白樺茸不同提物的制備

1.4.1.1白樺茸水提物的制備 白樺茸在純凈水溶液中經(jīng)83℃提取3.4h，料液比1:36（w/v），提取4次，通過(guò)熱水浸提的方式得到白樺茸水提物，其中1g水提物相當(dāng)于4.5g白樺茸[3]。

1.4.1.2白樺茸發(fā)酵液的制備 采用20L全自動(dòng)小型發(fā)酵罐進(jìn)行樺褐孔菌液體發(fā)酵，培養(yǎng)基配方：1%玉米淀粉，2%葡萄糖，0.2%蛋白脈，0.1% KH2PO4,0.05% MgSO4。實(shí)消冷卻后接入樺褐孔菌液體菌種（采用PDA加富培養(yǎng)基200mL，分裝于500mL三角瓶中，重復(fù)5次后封口，120℃高壓滅菌30min。冷卻后將樺褐孔菌菌種塊接入液體培養(yǎng)基中，27℃，200r·min-1，培養(yǎng)96h），接種量為10%，27℃，20r·min-1，培養(yǎng)8d后，將發(fā)酵液pH調(diào)至11～12，在100℃條件下提取lh，過(guò)濾菌球，取濃縮液加入85%乙醇中進(jìn)行醇沉，靜置24h后，取上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，離心后的沉淀冷凍干燥，稱質(zhì)量[4-5]。

1.4.1.3白樺茸醇提物的制備 白樺茸在30%乙醇溶液中經(jīng)85℃提取4h，料液比1:30（w/v），提取2次，通過(guò)水浴回流裝置得到白樺茸醇提物，將2次得到的白樺茸醇提物混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到濃縮液利用凍干機(jī)48h后得到凍干粉。其中1g提取物相當(dāng)于10g白樺茸。

1.4.2小鼠經(jīng)口急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)選取SPF級(jí)ICR小鼠60只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，將白樺茸水提物、白樺茸發(fā)酵液和白樺茸醇提物按照小鼠最大體積0.4mL·10g-1單次經(jīng)口給藥，觀察記錄小鼠死亡情況，根據(jù)小鼠給藥后的狀態(tài)和死亡數(shù)，來(lái)調(diào)節(jié)給藥劑量，找出各組小鼠全死亡和全不死亡的劑量，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)[6]。

1.4.3小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取SPF級(jí)ICR小鼠80只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機(jī)分成8組，分別為對(duì)照組、白樺茸水提物最大給藥濃度組、白樺茸發(fā)酵液最大給藥濃度組和白樺茸醇提物組（采用Bliss法，按照0.7倍劑量間距，將小鼠分為4.0、5.6、8.0、11.2、16.0g·kg-1·BW5個(gè)劑量組），每組10只，雌雄各半，馴化飼養(yǎng)3d，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12h，經(jīng)口單次予白樺茸不同提取物，對(duì)照組予等量的純凈水，灌胃3h后自由進(jìn)食[7-8]。

1.4.4觀察檢測(cè) 給藥后，觀察內(nèi)容包括動(dòng)物運(yùn)動(dòng)情況、眼瞼指征、呼吸、皮毛、排泄物和分泌物等。記錄動(dòng)物中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物的死亡情況并詳細(xì)登記，出現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖檢查。體質(zhì)量指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)期間稱量小鼠給藥第1天、第3天、第7天、第14天的體質(zhì)量。檢測(cè)臟器系數(shù)和主要臟器的病理檢查，小鼠解剖時(shí)，觀察臟器色澤、體積、質(zhì)地等變化；將心、肝、脾、肺、腎臟和腦于10%福爾馬林固定，修塊、脫水、包埋、切片、HE染色、封片，顯微鏡下觀察組織器官的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

體質(zhì)量采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用DAS軟件計(jì)算LD50和LD50的95%的可信限和回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白樺茸水提物組，通過(guò)予小鼠白樺茸水提物最大給藥濃度（10g·kg-1），觀察14d后，未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡。白樺茸發(fā)酵液組，通過(guò)予小鼠白樺茸發(fā)酵液最大給藥濃度（8g·kg-1），給藥后發(fā)現(xiàn)小鼠活動(dòng)減少，次日小鼠恢復(fù)正常狀態(tài)，觀察14d后無(wú)小鼠死亡。白樺茸醇提物組，發(fā)現(xiàn)通過(guò)予小鼠不同劑量的白樺茸醇提物，小鼠全部死亡的劑量為16.0g·kg-1，全不死亡的劑量為4.0g·kg-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，予小鼠白樺茸水提物最大給藥濃度（10g·kg-1），予小鼠白樺茸發(fā)酵液最大給藥濃度（8g·kg-1），予小鼠白樺茸醇提物采用Bliss法，按照0.7倍劑量間距，將小鼠分為4.0、5.6、8.0、11.2、16.0g·kg-1·BW5個(gè)劑量組，測(cè)LD50。

2.2 正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組給藥后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組無(wú)異常，小鼠予白樺茸水提物后，給藥當(dāng)日部分小鼠活動(dòng)減少，給藥次日發(fā)現(xiàn)少數(shù)小鼠有稀便，持續(xù)觀察至第3天小鼠恢復(fù)正常，至觀察期結(jié)束未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡；小鼠予白樺茸發(fā)酵液后，給藥當(dāng)日雄性和雌性各有2只小鼠活動(dòng)減少，持續(xù)觀察至第3天小鼠恢復(fù)正常，至觀察期結(jié)束未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡；小鼠予白樺茸醇提物后，給藥當(dāng)日小鼠活動(dòng)減少，16.0g·kg-1劑量組小鼠給藥后60min，4只雌性和3只雄性小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸，持續(xù)1min后死亡，給藥后75min剩余3只小鼠出現(xiàn)同樣癥狀，持續(xù)一段時(shí)間后死亡，11.2 g·kg-1劑量組小鼠給藥3h后，2只雌性和2只雄性小鼠呼吸急促，持續(xù)一段時(shí)間后死亡，剩余存活小鼠至觀察期結(jié)束未死亡，8.0g·kg-1劑量組小鼠給藥次日，發(fā)現(xiàn)有1只雌性和1只雄性小鼠死亡，5.6g·kg-1劑量組小鼠觀察至給藥后第3天，1只雌性小鼠死亡，4.0g·kg-1劑量組小鼠至觀察期結(jié)束，小鼠未發(fā)現(xiàn)異常狀態(tài)，未發(fā)生死亡。實(shí)驗(yàn)觀察期間，對(duì)所有死亡小鼠及時(shí)解剖，部分小鼠腸有脹氣現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)臟器有質(zhì)地、色澤等改變，剩余存活小鼠至觀察期結(jié)束麻醉后剖檢，小鼠皮毛、分泌物等未見(jiàn)異常，解剖觀察臟器未見(jiàn)異常。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)情況，見(jiàn)表1，表2。采用DAS1.0軟件，根據(jù)小鼠予白樺茸醇提物死亡情況計(jì)算，LD50為10.399g·kg-1，LD50的平均可信限（ML95）為1.735，LD50的95%可信限（L95）為8.808～12.278g·kg-1，LD50的平均可信限率（L95%）為0.167，斜率（b）為6.622，Sb為1.635，X50為1.017，Sx50為0.037，回歸方程為Y（幾率單位）=-1.735+6.622×log（D）。

表1 雌性小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)情況表 只

表2 雄性小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)情況表

2.3 各組小鼠體質(zhì)量變化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中，馴化飼養(yǎng)3d小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)，給藥時(shí)小鼠初始體質(zhì)量在22～24g，記錄小鼠1、3、7、14d的體質(zhì)量，各給藥組與對(duì)照組比較，小鼠予白樺茸水提物組的體質(zhì)量至3d時(shí)，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，至7d和14d體質(zhì)量與對(duì)照組相同呈上升趨勢(shì)；小鼠予白樺茸發(fā)酵液組體質(zhì)量至3d時(shí)，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，至7d和14d體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)；小鼠予白樺茸醇提物各組小鼠體質(zhì)量至3d，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，至7d，小鼠予白樺茸醇提物4.0、5.6組小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，小鼠予白樺茸醇提物8.0、11.2組小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，至14d，小鼠予白樺茸醇提物4.0、5.6組小鼠體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，小鼠予白樺茸醇提物8.0、11.2組小鼠體質(zhì)量略有上升。說(shuō)明白樺茸水提物和白樺茸發(fā)酵液?jiǎn)未喂辔赣栊∈蠛?，未影響小鼠的生長(zhǎng)，白樺茸醇提物單次灌胃予小鼠后，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)有一定的影響，見(jiàn)表3，表4。

表3 雌性小鼠體質(zhì)量變化情況 g

表4 雄性小鼠體質(zhì)量變化情況 g

2.4 小鼠臟器指數(shù)變化情況

小鼠臟器系數(shù)是臟器的重量與自身重量的比值，能初步反映小鼠整體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和病變情況，各給藥組小鼠臟器指數(shù)結(jié)果與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5，表6。初步判定不會(huì)對(duì)小鼠造成臟器的損傷。

表5 雌性小鼠臟器指數(shù)變化情況

表6 雄性小鼠臟器指數(shù)變化情況

2.5 小鼠主要臟器形態(tài)學(xué)檢查情況

通過(guò)對(duì)照組與白樺茸醇提物11.2g·kg-1組的心、肝、脾、肺、腎臟和大腦的組織病理觀察，白樺茸醇提物組小鼠肝臟與對(duì)照組相比偶見(jiàn)肝細(xì)胞散在性腫大及核濃縮，其他臟器未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的改變。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠主要臟器形態(tài)學(xué)情況（HE染色，×10）

3 討論

白樺茸不同提取物小鼠單次經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠予白樺茸水提物未發(fā)生死亡，個(gè)別小鼠有稀便現(xiàn)象和體質(zhì)量輕微下降的趨勢(shì)，可能與給予白樺茸水提物后影響小鼠腸蠕動(dòng)有關(guān)，次日恢復(fù)且體質(zhì)量呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，病理解剖觀察無(wú)異常，結(jié)果表明白樺茸水提物最大耐受劑量不低于10.0g·kg-1；小鼠予白樺茸發(fā)酵液未發(fā)生死亡，在給藥后小鼠活動(dòng)減少和體質(zhì)量有輕微的下降趨勢(shì)，可能因?yàn)樾∈笫艿剿幬锎碳さ脑?，次日逐漸恢復(fù)且體質(zhì)量呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，病理解剖觀察無(wú)異常，結(jié)果說(shuō)明白樺茸發(fā)酵液最大耐受劑量不低于8.0g·kg-1；小鼠予不同濃度的白樺茸醇提物有不同程度的死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的升高小鼠死亡的數(shù)量有升高的趨勢(shì)，死亡的時(shí)間有縮短的趨勢(shì)，小鼠死亡前呼吸急促、腹式呼吸，死亡后解剖觀察組織器官，發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生死亡可能與小鼠腸脹氣有關(guān)，經(jīng)計(jì)算白樺茸醇提物小鼠經(jīng)口急性毒性LD50為10.399g·kg-1，LD50的95%可信限（L95）為8.808～12.278g·kg-1，各給藥組小鼠的體質(zhì)量均有不同程度下降，說(shuō)明白樺茸醇提物對(duì)小鼠具有一定的毒性，并在組織病理形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)少數(shù)小鼠肝臟偶見(jiàn)病變，可能白樺茸醇提物對(duì)肝臟有一定毒性。

組織病理學(xué)可以通過(guò)形態(tài)學(xué)的改變來(lái)確定藥物毒性作用的靶器官，本研究主要對(duì)小鼠的心、肝、脾、肺、腎臟和大腦進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)有極顯著形態(tài)學(xué)的改變，可能與單次給藥和給藥周期過(guò)短有關(guān)，所以仍無(wú)法確定其靶器官，后期可以開(kāi)展長(zhǎng)期的毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)其臟器進(jìn)行組織病理檢查，確定白樺茸醇提物毒性作用的靶器官，并聯(lián)合代謝組學(xué)技術(shù)、基因組學(xué)技術(shù)等對(duì)白樺茸醇提物的毒性機(jī)制進(jìn)一步的探討，為白樺茸的研發(fā)和臨床使用提供可靠的保證。