宋寒冰，劉家興，王革強，張大鵬，姜益常，任樹軍，王 飛

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種代謝性骨病，其特征是骨量減少和微觀結(jié)構(gòu)惡化，最終引起脆性骨折效應(yīng)的風(fēng)險增加[1]。流行病學(xué)表明，OP和骨折已經(jīng)導(dǎo)致經(jīng)濟成本逐漸增加[2]。病理研究[3]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在骨頭形成中具有有益作用，已被確定為骨質(zhì)疏松癥治療的潛在靶標(biāo)。目前關(guān)于七厘散促進(jìn)骨折愈合的確切分子機制的報道較少，但是可以確定的是Wnt/β-catenin信號通路與骨細(xì)胞的生長、分化、凋亡密切相關(guān)，其是調(diào)控細(xì)胞形狀、功能、增殖、分化的關(guān)鍵信號通路之一[4]，并且Wnt/β-catenin信號通路參與骨骼生長和重塑[5]，但七厘散膠囊能否激活Wnt/β-catenin尚不清楚。研究[6]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀和七厘散都能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，提高愈傷組織質(zhì)量。研究[7]使用七厘散片對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行增殖和礦化,發(fā)現(xiàn)七厘散可以在加入培養(yǎng)后的24h和48h增強ALP活性和鈣結(jié)節(jié)。本研究首先制備了七厘散含藥血清，并進(jìn)一步研究其對骨膜間質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的增殖和成骨分化以及與Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

七厘散由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)系提供。胎牛血清（FBS），α-最低必需培養(yǎng)基（α-MEM）以及青霉素和鏈霉素購于碧云天（中國北京）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OIM）購自Sciencell公司（美國）。ICG001（抑制劑）購自碧云天（中國北京）。ELISA檢測試劑盒購自武漢博士特公司（中國武漢）。化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自索萊寶（中國北京），抗體β-catenin、Wnt7、Wnt4a、Osteocalcin、Runx2、β-actin購自Abcam（美國加利福尼亞州）。

1.2 動物

SD大鼠10只，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為SCXX（京）2011-0011。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)（中國黑龍江）。飼養(yǎng)方法：晝夜明暗交替時間為12h/12h，溫度18～26℃，相對濕度40%～70%，自由飲水進(jìn)食。實驗組組SD大鼠0.5g·kg-1七厘散灌服，灌胃6h制得含藥血清，空白對照組灌服等劑量的生理鹽水。本實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在給大鼠灌胃七厘散6h后，獲得七厘散含藥血清。使用密度梯度離心法從5只大鼠中獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）。取幼齡SD大鼠骨膜，Ⅱ型膠原酶消化后收集消化液并離心，培養(yǎng)液為含以10% FBS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OIM）培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)與傳代，將第三代細(xì)胞用于實驗。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞增殖試驗MTT法測定七厘散含藥血清對BMSCs的增殖的影響。將BMSC以1×104/孔的密度接種在96孔板中，并在α-MEM中孵育24 h，在加入七厘散含藥血清后培養(yǎng)1、2、3、7、14天。在每個時間點，首先舍去上清液，每孔加入1mg·mL-1的MTT溶液，每孔100μL，37℃，5% CO2孵育4h后，再棄去上清，每孔加入150μL的DMSO，在酶標(biāo)儀中震蕩1～2min，560nm下測定其吸光度。

1.4.2ALP活性測定 當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OIM）與七厘散含藥血清的OIM中培養(yǎng)第1、2、3、7、14天時，各組的ALP活性使用ELISA試劑盒進(jìn)行測定。

1.4.3RT-PCR檢測Trizol提取細(xì)胞總RNA，并用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時熒光定量PCR。引物序列如下：Wnt4a F，5′AGCCTTCGTTGCTGTGGAGA3′，Wnt4aR，5′TGGTGTCATAAGGATGGTGG3′；Runx2F，5′AGGGTCCTACACATACTTCG3′，Runx2R，5′GGTCCTTGGTTAGCATTCTC3′；OsteocalcinF，5′CAAACTGCTAAATGACGAGG3′，OsteocalcinR，5′GGGAAAGGTTGTGTAGGGTC3′；β-ActinF，5′AGATCCTGACCGAGCGTGGC3′，β-ActinR，5′CCAGGGAGGAAGAGGATGCG3′；Wnt7F，5′ACATGGTCACGGAGCGTGGC3′，Wnt7R，5′CGGCCCATGATGAGTATCCT3′。我們使用β-肌動蛋白作為參考對照。Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7的相對mRNA水平表示為歸一化為β-肌動蛋白mRNA的倍數(shù)變化，并根據(jù)2-ΔΔCt比較法。RT-PCR反應(yīng)條件為：94℃、2min；53℃、20s，60℃、40s，共45個循環(huán)。GAPDH的cDNA經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行同期PCR，用于回歸分析。

1.4.4WesternBlot將培養(yǎng)了14d的BMSC使用含有苯甲烷磺酰氟（PMSF）的RIPA緩沖液裂解進(jìn)行裂解后，通過BCA測定法定量蛋白質(zhì)濃度。然后將所提的蛋白以30μg的量在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中分離，分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜2h，然后Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7抗體（均以1:2000稀釋，含5%脫脂孵育牛奶）在室溫下孵育2h。用TBST-Tween-20洗滌BMSC3次（每次5min），然后與二抗（驢多克隆抗兔）一起溫育2h。通過增強的化學(xué)發(fā)光檢測試劑檢測，并用ChemiDocTMXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。使用單向ANOVA評估結(jié)果，P值計算采用非配對雙邊t檢驗進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七厘散含藥血清顯著促進(jìn)BMSCs 增殖

MTT檢測細(xì)胞活性結(jié)果表明，七厘散含藥血清處理組在第1、2、3、7、14天時都能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，但不具有顯著性差異。與七厘散含藥血清處理組相比，ICG001（5μM，25μM）組中BMSCs增殖程度明顯降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 MTT測定分析BMSC增殖

2.2 七厘散含藥血清增加ALP 活性

與對照組相比，七厘散含藥血清處理組在第1、2、3、7、14天顯著增加ALP活性且有統(tǒng)計學(xué)意義。與七厘散含藥血清組相比，當(dāng)加入抑制劑ICG001（5μM，25μM）后，其能明顯抑制ALP活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 4個組別的ALP 活性測定

2.3 七厘散含藥血清增加Wnt /β-catenin 通路相關(guān)基因表達(dá)

PCR結(jié)果表明，與對照組相比，七厘散含藥血清組能夠顯著上調(diào)成骨基因Runx2，Osteocalcin的表達(dá)以及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。當(dāng)加入抑制劑ICG001（5μM，25μM）后，七厘散含藥血清的作用得到抑制，但是基因Wnt7以及Wnt4a未受到明顯抑制。見圖3。

圖3 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d 后，七厘散含藥血清和ICG001抑制劑對成骨基因在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的影響

2.4 ICG001抑制劑阻斷Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Westernblot結(jié)果顯示七厘散含藥血清顯著上調(diào)Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt7和Wnt4a表達(dá)。加入抑制劑ICG001（5μM，25μM）后阻斷Runx2，Osteocalcin，β-catenin表達(dá)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，但Wnt7和Wnt4a的表達(dá)未受影響。見圖4。

圖4 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d 后，七厘散含藥血清和ICG001抑制劑對總β-catenin 蛋白在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的影響

3 討論

報道[8]表明Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)了BMSC向成骨細(xì)胞分化。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)是骨生物學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，目前尚不清楚七厘散膠囊能否激活Wnt/β-catenin信號并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨。本實驗探究七厘散對成骨基因和Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)七厘散可以提高Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7的mRNA水平。加入ICG001抑制劑后，Runx2，Osteocalcin和β-catenin的表達(dá)水平顯著降低，25μMICG001具有更明顯的抑制作用，但該抑制劑對Wnt4a和Wnt7表達(dá)沒有影響，類似的結(jié)果在蛋白水平得到確證。其原因可能是因為ICG001主要針對β-catenin，而對更上游的蛋白Wnt7和Wnt4a的表達(dá)沒有影響[9]。

綜上所述，七厘散通過增加Runx2和Osteocalcin的表達(dá)而促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化，并激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)增加成骨性，從而發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用。