袁躍華， 宋江濤， 鮑雅妍， 王艷艷， 張振國， 衛(wèi)迎潔， 田茂忠*,2

(1.山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009；2.大連理工大學精細化工國家重點實驗室，遼寧大連 116024)

微量銅對生物體是必不可少的，因為它在生物體的生理和代謝過程中起著非常重要的作用，包括自由基解毒、線粒體氧化磷酸化、神經(jīng)遞質合成和變性、結締組織合成、色素形成和鐵代謝[1]。因此，適量的銅有助于維持免疫系統(tǒng)和神經(jīng)細胞的正常功能。生物體內(nèi)銅的存在也有助于膠原蛋白的形成，而膠原蛋白是結締組織和骨骼[2]的重要組成部分。然而，過多的銅會催化活性氧(ROS)的形成[3]，導致神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病[4]、門克斯病[5]、威爾遜病[6]。人體內(nèi)缺乏銅也會導致許多疾病，包括骨髓發(fā)育異常、貧血[7]。因此，對食品、飲用水和活細胞中Cu2+的檢測是非常重要的。

熒光法檢測Cu2+因其具有高靈敏度、高選擇性、原位實時檢測、價格低廉等優(yōu)點而成為一種很好的檢測方法[8-10]。其中，近紅外熒光探針對生物樣品的光損傷小，且穿透組織較深，不易受到生物體自熒光的干擾，因此更有利于生物熒光成像[11,12]。此外，在復雜的生物體中，僅通過增加或減少熒光強度很難準確地檢測被分析物的濃度。相比之下，比率熒光探針利用兩種不同波長的光發(fā)射，消除了儀器、探針濃度、光漂白和微環(huán)境等引起的誤差[13]。但是，有關近紅外比率Cu2+熒光探針目前報道的還較少[14-18]。在本工作中，我們開發(fā)了一種新的基于羅丹明染料和菁染料衍生物的近紅外比率Cu2+熒光探針，并成功地將該探針用于活HeLa細胞中Cu2+的熒光成像。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Ascend400核磁共振儀，購自瑞士Bruker公司；Saturn 2200/2100質譜儀，購自美國Varian公司；F-2500 熒光分光光度計，購自日本Hitachi公司；Lambda35紫外光譜儀，購自美國PerkinElmer公司；R215型旋轉蒸發(fā)儀，購自瑞士Buchi公司；pHS-25B型pH酸度計，購自上海大中分析儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，購自鞏義市予華儀器有限公司。

探針RCy7標準溶液：準確稱取一定量的探針RCy7，溶于二甲亞砜中，配制成1.0×10-2mol/L的貯備溶液，使用時根據(jù)需要適當稀釋。金屬離子標準溶液：準確稱取一定量的各金屬離子硝酸鹽，溶于二次蒸餾水中，配制成5.0×10-2mol/L的貯備溶液，使用時根據(jù)需要適當稀釋。通過HCl調(diào)節(jié)Tris堿的pH為7.2，配制20 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液。柱層析硅膠(200～300目)購自青島Makall公司。羅丹明B購自百靈威試劑有限公司；2,3,3-三甲基吲哚購自阿拉丁試劑公司；溴己酸、乙二胺、環(huán)己酮和其它試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純；水為二次蒸餾水。

1.2 探針的制備

探針RCy7的合成路線如下所示：

1.2.1 化合物2的合成化合物3、4、1按文獻報道的方法[19,20]合成。將1.22 g(4.3 mmol)化合物4和0.36 g(2 mmol)化合物3加入50 mL的單口燒瓶中，再加入15 mL甲苯和35 mL正丁醇，然后在氮氣保護下回流5 h，待生成的綠色溶液冷卻后減壓蒸去溶劑。用丙酮和甲醇重結晶粗產(chǎn)品得到483.1 mg綠色粉末化合物2(29.1%)。

1H NMR(500 MHz,CDCl3)：δH：8.33(d,J=14.0 Hz,2H),7.38(d,J=7.4 Hz,4H),7.25(d,J=7.4 Hz,2H),7.18(d,J=7.4 Hz,2H),6.25(d,J=14.0 Hz,2H),4.23(t,J=6.9 Hz,4H),4.03(t,J=6.9 Hz,4H),2.73(s,4H),2.32(t,J=7.4 Hz,4H),2.08(s,1H),1.99(d,J=5.2 Hz,2H),1.92～1.81(m,4H),1.72(d,J=7.7 Hz,15H),1.61～1.49(m,8H),1.34(dd,J=14.0,7.4 Hz,4H),0.91(t,J=7.4 Hz,6H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)：δC：173.45,172.41,172.30,150.34,147.83,144.26,142.20,141.10,141.04,129.44,128.84,127.57,125.34,122.27,110.94,101.84,101.47,64.24,49.37,49.33,44.74,33.91,30.63,28.13,28.08,27.63,27.20,26.64,26.47,24.60,20.75,19.11,13.69。

高分辯質譜(HRMS)(ESI)m/z:C50H68ClN2O4[M]+計算值：795.4862;實測值：795.4956。

1.2.2 熒光探針RCy7的合成將555 mg(1.147 mmol)化合物1和200 mg(0.229 mmoL)化合物2加入50 mL的單口梨形燒瓶中，再加入20 mL無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后在70 ℃下氮氣保護攪拌反應，薄層色譜跟蹤。待反應結束后，減壓除去溶劑，把固體溶在2 mL的二氯甲烷中。用200～300目的硅膠柱色譜分離，洗脫溶劑為三氯甲烷/甲醇=30∶1,得到199.7 mg的深藍色固體RCy7(63.8%)。

1H NMR(500 MHz,CDCl3)：δH：9.63(s,1H),7.91(d,J=5.9 Hz,1H),7.64～7.52(m,4H),7.34～7.30(m,2H),7.27(s,1H),7.17(d,J=5.9 Hz,1H),7.10(t,J=7.4 Hz,2H),6.90(d,J=7.4 Hz,2H),6.52(d,J=8.8 Hz,2H),6.41(s,2H),6.34(d,J=8.8 Hz,2H),5.63(s,1H),5.61(s,1H),4.08(t,J=6.6 Hz,4H),3.85(s,4H),3.48～3.54(m,4H),3.45～3.27(m,8H),2.50(s,4H),2.35(t,J=7.2 Hz,4H),1.90～1.76(m,6H),1.75～1.69(m,6H),1.59～1.61(m,15H),1.49(d,J=6.8 Hz,4H),1.36～1.40(m,4H),1.19(t,J=6.9 Hz,12H),0.94(t,J=7.4 Hz,6H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)：δC：173.52,170.43,169.00,166.91,153.88,153.46,149.10,143.09,140.10,137.12,133.45,129.95,128.56,128.29,124.28,122.81,122.65,121.78,119.39,108.58,108.39,104.11,98.01,94.19,64.29,52.43,47.51,44.46,43.09,42.12,34.03,31.94,30.66,29.71,29.37,28.63,26.66,26.31,26.03,24.67,22.70,21.11,19.14,14.13,13.72,12.65。

HRMS(ESI)m/z:C80H103N6O6[M]+計算值：1 243.7934;實測值：1 243.8485。

1.3 光譜測量

按照下面方法進行滴定實驗：將10 μL的RCy7(5 mmol/L)溶液加到體積比為1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)緩沖溶液中，用微量進樣器逐漸加入一定量Cu2+儲備溶液。

選擇性實驗按照下面方法進行：在5 mL含RCy7(10 μmol/L)的緩沖溶液(pH=7.2)中，加入5 μL金屬離子儲備溶液，光譜分析前，室溫下放置1 h。紫外-可見吸收光譜在300～800 nm波長范圍內(nèi)記錄。熒光光譜在560～800 nm波長范圍內(nèi)記錄，激發(fā)波長為550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5.0 nm。

1.4 細胞成像

HeLa細胞購自中國科學院上海細胞庫。將HeLa細胞鋪于共聚焦培養(yǎng)皿，用DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，第二天待細胞貼壁后，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次，然后加入0.5 mL的DMEM和10 μmol/L的RCy7，在37 ℃下孵化1 h。為了除去殘留的RCy7緩沖液，用PBS沖洗細胞3次，然后分兩組，在一組中加入DMEM(0.5 mL)和50 μmol/L的Cu2+溶液，孵育細胞60 min后使用PBS洗去多余的Cu2+，然后在Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡下觀察細胞，并進行拍攝。采用552 nm的激光激發(fā)，接收波長范圍分別為560～650 nm和680～800 nm。物鏡采用630X油鏡進行拍攝。

圖1 探針RCy7(10 μmol/L)對Cu2+(0～100 μmol/L)響應的紫外-可見光譜(a)和熒光光譜(b)(插圖是確定探針RCy7和Cu2+絡合比的Job曲線，縱坐標對應的發(fā)射波長：577 nm)Fig.1 UV-Vis spectra(a) and fluorescence spectra(b) of RCy7(10 μmol/L) for Cu2+(0-100 μmol/L)(Inset:Job’s plot for RCy7.Emission wavelength:577 nm)

2 結果與討論

2.1 光譜分析

為了研究探針RCy7對Cu2+傳感性能，在體積比為1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)緩沖溶液中，進行了紫外-可見光譜滴定和熒光滴定實驗(圖1)。由圖1(a)可見，隨著Cu2+的不斷加入，探針RCy7在633 nm處的強吸收峰逐漸減弱，并且在516 nm附近出現(xiàn)了一個新的弱吸收峰，吸收峰藍移達119 nm。由圖1(b)所示，自由探針RCy7的最大熒光發(fā)射峰是722 nm，這是Cy7染料的特征發(fā)射峰。隨著Cu2+濃度的逐漸增大，探針RCy7在722 nm處熒光強度不斷減小，577 nm處熒光強度不斷增大，最大發(fā)射峰藍移145 nm，因此，該探針可以實現(xiàn)有效地近紅外比率檢測，提高檢測準確度。發(fā)射光譜藍移是由于Cu2+誘導羅丹明酰胺環(huán)開環(huán)，同時伴隨著從Cy7染料到Cu2+絡合中心的光誘導電子轉移(PET)引起的[15]。探針RCy7對Cu2+響應機理如圖2所示。在577 nm和722 nm處熒光強度的比率(I577/I722)增大了近60倍。Cu2+的濃度在0～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與探針熒光發(fā)射強度比率(I577/I722)呈良好線性關系，線性回歸方程為：y=0.45x+0.04，相關系數(shù)R2=0.9928，Cu2+檢出限為1.09×10-8mol/L。上述結果表明，探針RCy7可以比率檢測此范圍內(nèi)Cu2+的含量，靈敏度高。此外，利用Job’s plot方法確定了RCy7和Cu2+的絡合比為1∶1，見圖1(b)插圖，高分辨質譜(HRMS)也證實了這一結果，[RCy7+Cu]2+的計算值：1 306.7219；實測值：1 306.7253。

圖2 探針RCy7對Cu2+的響應機理Fig.2 The responding mechanism of the probe RCy7 toward Cu2+

2.2 探針RCy7對金屬離子的選擇性

通過吸收光譜和熒光光譜研究了在體積比為1∶1的乙腈/Tris-HCl(20 mmol/L，pH=7.2)緩沖溶液中探針RCy7對不同金屬離子的識別情況。由圖3(a)可見，只有當加入5倍量的Cu2+后，RCy7在波長633 nm處的強吸收峰才消失，同時溶液顏色從藍色變?yōu)榈t色。其他常見金屬離子(Na+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Co2+、Cd2+、Ni2+、Al3+、Ag+、Cr3+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Fe3+、Hg2+)都沒有引起探針吸收光譜明顯的變化。由圖3(b)所示，只有當加入5倍量的Cu2+后，RCy7的熒光發(fā)射光譜才發(fā)生明顯變化，最大發(fā)射峰從722 nm藍移到577 nm，這和吸收光譜的變化相似，探針對相同量的其他金屬離子不敏感。RCy7-Cu2+溶液在577 nm和722 nm處熒光強度的比率(I577/I722)為26.25，而RCy7僅為0.44。此外，一些活性氧、活性硫與氨基酸(H2O2、ONOO-、O2-、ClO-、H2S、Hcy、Cys、GSH)對Cu2+檢測的干擾也很小。競爭性實驗也證實常見的這些離子不干擾探針對Cu2+的特異性識別。結果表明，此探針近紅外比率檢測Cu2+具有良好的選擇性。

圖3 探針RCy7(10 μmol/L)對不同金屬離子(50 μmol/L)的選擇性Fig.3 Selectivity of probe RCy7(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L) (a) Absorption spectra;(b) Fluorescence spectra.

圖4 pH對探針RCy7熒光強度比率(I577/I722)的影響Fig.4 Influence of pH on the fluorescent intensity ratio(I577/I722) of RCy7 (a) Free Probe RCy7(10 μmol/L);(b) Probe RCy7+Cu2+.[Cu2+]=50 μmol/L，Excitation at 550 nm.

2.3 pH的干擾

由于在生物體內(nèi)檢測Cu2+常會受到pH的干擾，故考察了不同pH體系中探針RCy7的熒光性能。如圖4所示，不加Cu2+和加入50 μmol/L Cu2+時，在pH=5.5～11.3范圍內(nèi)pH對探針RCy7熒光光譜的影響都較小，但是加入Cu2+會引發(fā)比率信號明顯增強，所以該探針可在生物體內(nèi)于中性pH條件下檢測Cu2+的濃度。

2.4 密度泛函理論(DFT)計算

通過Job’s plot和HRMS方法已經(jīng)證實了RCy7和Cu2+的絡合比是1∶1。為了進一步了解RCy7對Cu2+的絡合機理，我們利用Gaussian 16[21]進行了DFT計算(圖5)。圖5a和5d是利用DFT優(yōu)化的結構圖，從圖中可以看到，Cu2+和螺酰胺的氧原子和乙二胺中的一個氮原子鍵合，使得羅丹明螺酰胺環(huán)打開，從而導致羅丹明母體熒光增強；而從Cy7染料到Cu2+絡合中心的PET引起Cy7染料熒光減弱。計算得到RCy7和RCy7-Cu2+的HOMO-LUMO能隙分別是2.28 eV與1.23 eV，因此RCy7和Cu2+的絡合在能量上是有利的[22]。

圖5 利用DFT計算的優(yōu)化結構圖：RCy7-Cu2+(a),RCy7(d)。碳、氮、氧和銅原子分別用灰色、藍色、紅色、磚紅色表示。(b,e) HOMO軌道圖。(c,f) LUMO軌道圖。Fig.5 DFT optimized structure of RCy7-Cu2+(a) and RCy7(d).The carbon,nitrogen,oxygen and copper atoms are colored in gray,blue,red and brick-red,respectively.(b,e) HOMO orbital plots.(c,f) LUMO orbital plots.

2.5 RCy7的細胞成像應用

為了確定RCy7在生物體系中的應用價值，我們做了在HeLa細胞內(nèi)Cu2+的激光共聚焦熒光顯微成像實驗(圖6)。沒有加入Cu2+的情況下，在HeLa細胞中可看到探針RCy7中菁染料發(fā)射的熒光(680～800 nm)。加入Cu2+孵化60 min后，可以看到HeLa細胞中羅丹明染料發(fā)射的強熒光(560～650 nm)，同時菁染料的熒光猝滅。結果證明，RCy7能滲透細胞膜，可以用于檢測活HeLa細胞中的Cu2+。

圖6 HeLa細胞激光共聚焦熒光成像。(A)用RCy7(10 μmol/L)孵育(a～e);(B)用RCy7(10 μmol/L)孵育過的細胞，再用Cu2+(50 μmol/L)孵育(f～j)。(a,f)：560～650 nm成像通道；(b,g)：680～800 nm成像通道；c和h分別是a和f的明場；d是a和c的疊加圖；e是b和c的疊加圖；i是f和h的疊加圖；j是g和h的疊加圖；激發(fā)波長：552 nm。比例尺：25 μm。Fig.6 Confocal fluorescence images of cells.(A) after treating with 10 μmol/L of RCy7(a-e);(B) after adding 50 μmol/L of Cu2+ to the cells treated by RCy7(f-j).(a,f) Image in the channel(560-650 nm);(b,g) image in the channel(680-800 nm);(c,h) bright-field image of panels a and f;(d) merged image of panels a and c;(e) merged image of panels b and c;(i) merged image of panels f and h;(j) merged image of panels g and h.Both channels are excitated at 552 nm.Scale bar:25 μm.

3 結論

我們設計并合成了一種新型近紅外比率Cu2+熒光探針。在探針RCy7溶液中加入Cu2+后，Cu2+會引發(fā)探針最大熒光發(fā)射峰藍移，從而實現(xiàn)了近紅外比率檢測Cu2+。檢測Cu2+的靈敏度高、選擇性好，檢出限為1.09×10-8mol/L。在中性水溶液中探針對pH不敏感。更重要的是探針在活HeLa細胞中對Cu2+的激光共聚焦熒光成像，證明其具有一定的生物應用價值。