陸奕娜*， 張林田， 魏建華， 陳建偉， 呂堅羚

(汕頭海關(guān)技術(shù)中心,廣東汕頭 515041)

硒是人體必需的一種微量元素[1]。硒參與合成人體內(nèi)多種含硒酶和含硒蛋白[2]，也是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心[3]。流行病學調(diào)查表明，飲食中硒攝入量與乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌的死亡率呈明顯的負相關(guān)性[4,5]。硒與維生素E、大蒜素、亞油酸、鍺、鋅等營養(yǎng)素具有協(xié)同抗氧化作用[6]，增強抗氧化活性。另外，硒具有減輕和緩解重金屬毒性的作用[7]。缺硒是克山病、大骨節(jié)病兩種地方性疾病的主要病因[8,9]。硒能徹底清除對人體有害的自由基[10]，修復細胞組織的損傷[11]。同時硒也具有毒性,硒攝入量過多，對人體會造成危害,當日均攝入量為750～950 g時，則會引起硒中毒[10]。人、馬及牛一次服用硒的最小致死劑量分別為2～4 mg/kg體重、1.5 mg/kg體重、45～5 mg/kg體重[12]。中國營養(yǎng)學會推薦的成年人攝入量為50～200 μg/d[6]。硒的毒性和生物利用度在很大程度上取決于硒的化學形態(tài)，硒酸鹽及亞硒酸鹽毒性較大[13]，亞硒酸鈉的毒性略大于硒酸鈉[14]，硒化氫的毒性最大[15]，會導致生物體病變，在日本1993年已禁止在食品和飼料中添加無機硒[16,17]。硒代蛋氨酸等有機硒則是人類攝取硒元素的主要來源[18]，不同硒形態(tài)的毒性亦不同，因此無論對食品安全、環(huán)境樣品，還是從事與硒有關(guān)的工作人員或硒中毒患者的體液進行硒形態(tài)分析和監(jiān)測都是有必要的，準確地定性定量分析不同形態(tài)和價態(tài)的硒對保障食品安全生產(chǎn)、人類健康具有重要意義。

國內(nèi)尚無多種硒形態(tài)同時測定的國家標準或行業(yè)標準，目前報道硒形態(tài)的檢測方法主要有分光光度法、毛細管電泳-電化學發(fā)光法、液相色譜法等，但均存在樣品前處理復雜或檢測硒形態(tài)種類較少等不足，效率低。高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)具有接口簡單、應(yīng)用廣泛、檢出限低、分離效率及靈敏度高等優(yōu)點，在元素形態(tài)分析上具有一定的優(yōu)勢。目前有報道利用HPLC-ICP-MS測定食品中硒形態(tài)，但檢測的硒形態(tài)種類較少[19]。本文采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，建立了同時快速測定食品中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt) 7種硒形態(tài)的分析方法。

1 實驗方法

1.1 主要儀器及操作條件

美國安捷倫Agilent 1200 高效液相色譜儀，配四元泵及自動進樣器。HPLC條件：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(用甲酸調(diào)pH至4.4)，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，1 min內(nèi)流速逐步升至1.2 mL/min，5～10 min，流速為1.2 mL/min。美國安捷倫Agilent 7700X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。ICP-MS條件：射頻功率1 450 W，測質(zhì)量數(shù)78Se，采樣周期為0.8 s，采集時間為600 s，載氣為高純氬氣，同心霧化器，載氣流量為1.00 L/min。國產(chǎn)科貝爾CBL C9860A 型超聲波萃取儀；德國海蒂詩Hettich高速離心機；國產(chǎn)恒奧公司HGN-24A氮吹儀；美國密理博Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試劑

硒標準物質(zhì)：Se(Ⅳ)(GBW10032,濃度68.9±1.4 μg/g)、Se(Ⅵ)(GBW10033,濃度75.1±2.4 μg/g)、SeCys2(GBW10087,濃度93.5±2.5 μg/g)、SeMeCys(GBW10088,濃度96.6±2.6 μg/g)、SeMet(GBW10034,濃度97.9±2.5 μg/g)、SeUr(213170010 A0369556)、SeEt(Cat#S250000)，均購于國家標準物質(zhì)研究中心，使用前用水配制成1.00 mg/L標準儲備溶液，于0～5 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

比較了5種樣品提取方式：(1) 水提取法[20]：稱取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL水，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清液過0.45 μm濾膜至進樣小瓶。(2) 10 mmol/L檸檬酸(pH=5.60)提取法[21]：稱取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL濃度為10 mmol/L檸檬酸(pH=5.60)，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10min，取清液過0.45 μm濾膜至進樣小瓶。(3) 0.1 mol/L HCl提取法[19]：稱取樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL濃度為0.1 mol/L HCl，混均，超聲萃取2 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清液過0.45 μm濾膜至進樣小瓶。(4) 甲醇-水提取法[20]：稱取樣品1.00 g于15 mL離心管內(nèi)，加入20 mL甲醇水溶液，混勻，超聲萃取2 h，50 ℃ 吹氮濃縮至1～2 mL，冷卻，加入少許去離子水轉(zhuǎn)移至10 mL離心管內(nèi)，定容至10 mL，取清上液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min， 取上清液過0.45 μm濾膜至進樣小瓶(注意甲醇不能完全蒸干，否則影響提取效率)。(5) 水-酶提取法[20]：稱取樣品1.00 g于25 mL離心管中，加20 mL水，超聲10 min，加入20 mg蛋白酶XⅣ，在37 ℃的恒溫水浴搖床上振蕩8 h。取清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取清上液過0.45 μm濾膜至進樣小瓶。

取所得上清液50 μL引入HPLC-ICP-MS儀進行測定。如果離心后的溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，則將離心機溫度設(shè)置為0 ℃重新離心，樣品中的油脂分層凝固在離心管上層，用小勺小心去除；或離心完成后將離心管置于冰箱冷藏保存2～3 h以上，取出后去除上層油脂層，取1 mL溶液再過0.45 μm濾膜至進樣小瓶，供HPLC-ICP-MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇分別采用安捷倫TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、安捷倫XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、AichromBond-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、資生堂Shiseido C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hamilton PRP-X100陰離子分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)、安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)對硒形態(tài)進行分離。實驗表明，Hamilton PRP-X100陰離子分析柱(250 mm×4.1 mm,10μm)能有效分離出5種硒形態(tài)，色譜圖見圖1a；安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱能有效分離出7種硒形態(tài)，色譜圖見圖1b；其他4種色譜柱均出現(xiàn)色譜峰重疊的情況。因此采用安捷倫ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱。

圖1 采用Hamilton PRP-X100色譜柱(a)及安捷倫SB-Aq C18色譜柱(b)分離的色譜圖Fig.1 Chromatograms using Hamilton PRP-X100 ion column and Agilent SB-Aq C18 reversed phase column

2.1.2 流動相的選擇本實驗分別采用5 mmol/L檸檬酸(pH=4.7)、40 mmol/L (NH4)2HPO4(pH=6.0)、20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)等多種不同的流動相對硒形態(tài)進行分離，5 mmol/L 檸檬酸(pH=4.7)、40 mmol/L(NH4)2HPO4(pH=6.0)最多只能分離出5種硒形態(tài)，20 mmol/L 檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)能有效分離出7種硒形態(tài)。最終確定采用20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L已烷磺酸鈉(pH=4.4)作為硒形態(tài)色譜分離的流動相。

2.1.3 柱溫的選擇設(shè)置柱溫分別為20、22、24、26、30、32 ℃對7種硒物質(zhì)進行分離。實驗表明，不同柱溫對7種硒形態(tài)的分離檢測結(jié)果沒有影響。因此，將柱溫設(shè)置為室溫，利用空調(diào)及抽濕機保證實驗過程中環(huán)境的一致性。

2.2 樣品前處理過程的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇選擇上述5種提取液對富硒酵母進行超聲萃取，對應(yīng)添加濃度為100 μg/kg的7種硒化合物，并將處理完畢的上清液進行HPLC-ICP-MS檢測，對比5種提取液對7種硒形態(tài)的萃取效果。7種硒化合物的檢測結(jié)果見表1。實驗結(jié)果顯示，0.1 mol/L HCl 、10 mmol/L 檸檬酸(pH=5.6)溶液提取各硒形態(tài)分離效果較差，峰形不突出，回收率較差；甲醇-水(1∶l)、水-酶及水3種溶劑提取效果相近，但是甲醇-水(1∶l)的前處理過程比較復雜，甲醇毒性較大，且高含量的甲醇進入ICP-MS儀容易使矩管積碳，因此還必須通過蒸發(fā)儀或吹氮儀將甲醇除去，前處理繁瑣、步驟多，提取時間較長；水-酶法提取過程需要37 ℃的恒溫水浴搖床上振蕩8 h，提取時間較長，且酶的價格相對較高。因此，本實驗采用效率最高、安全性較大且前處理時間較短的水提取法。

表1 不同前處理對富硒酵母硒形態(tài)結(jié)果的影響(n=3)

2.2.2 提取時間選擇取富硒酵母膠囊、富硒片劑兩種含硒較豐富的產(chǎn)品，按萃取時間分別為60、90、120、150、180 min進行萃取，結(jié)果表明萃取時間為120 min時，萃取效果最佳，既可保證最大提取效率，又可節(jié)約分析時間。

2.2.3 提取次數(shù)的影響以麥胚芽、茶葉等為研究對象，以7種硒化合物為主要參考指標，10 mL去離子水超聲提取120 min，混均，取上清液于1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心15 min，過0.45 μm濾膜，吸取上清液為第一次提取液。殘渣再用提取液提取，重復操作二次。將上述三次提取液按規(guī)定的凈化步驟處理后上機測定，比較三次提取液的測定值。結(jié)果表明超聲提取一次，被測物基本已經(jīng)提取完全，僅有很少一部分被測物殘留在殘渣里(約占5%或檢不出)。第三次提取液中7種硒形態(tài)化合物均為未檢出。綜合考慮本研究確定的提取次數(shù)為一次。

2.2.4 標準溶液穩(wěn)定性將濃度分別為2.5、5、10、20、50、100 μg/L的7種硒化合物混合溶液，分別在低溫避光(棕色瓶0～5 ℃冰箱)及常溫不避光條件下存放，3、10、20、30 d后檢測，在低溫及避光環(huán)境下，高濃度的7種硒形態(tài)，除了SeUr及SeEt兩種硒形態(tài)外，其他5種硒形態(tài)的計數(shù)較為穩(wěn)定，低濃度下的5種硒形態(tài)隨著存放時間的延長，濃度會出現(xiàn)一定程度的下降趨勢，但是SeUr及SeEt兩種硒形態(tài)無論是高濃度溶液或者低濃度溶液，濃度隨著存放時間的延長會出現(xiàn)急劇下降。

在常溫及光照環(huán)境下，7種硒形態(tài)的濃度均隨著存放時間的延長而變化，除了Se(Ⅳ)外，其他6種硒形態(tài)基本隨著時間的延長而下降。無論時高濃度還是低濃度的硒形態(tài)標準溶液在常溫條件下均處于不穩(wěn)定狀態(tài)，光照會使硒形態(tài)的化學狀態(tài)發(fā)生變化，如硒脲光照及一定的溫度會發(fā)生分解，有效濃度的硒脲溶液應(yīng)是淺粉色的，隨著光照及存放時間的增加分分解變成無色液體。有些硒形態(tài)會發(fā)生化學還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化成Se(Ⅳ)，因此，Se(Ⅳ)的濃度反而隨著光照時間的延長而上升。

由于硒形態(tài)的化學不穩(wěn)定性，標準溶液一般是現(xiàn)配現(xiàn)用；購買回的樣品及處理完畢的待測液要存放在避光及低溫環(huán)境中，并盡快上機檢測。

2.3 標準曲線及定量限

配制濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt標準工作溶液系列，按建立的方法進行分析，以標準溶液中被測組分峰面積計數(shù)為縱坐標(y)，被測組分濃度為橫坐標(x)，繪制標準工作曲線。結(jié)果表明，Se(Ⅵ) 、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt 7種硒化合物在2.5～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均>0.999?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)、各被測組分保留時間列于表2。

表2 線性參數(shù)及檢測限

采用濃度為2.5 μg/L的7種硒化合物混合標準溶液色譜圖，以3倍信噪比計算檢測限，再根據(jù)本方法所規(guī)定的取樣量計算方法檢測限。最終確定食品中Se(Ⅵ) 、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet、SeEt 7種形態(tài)化合物的檢測限均為0.005 mg/kg。

2.4 精密度與回收試驗

2.4.1 陰性樣品驗證取陰性樣品多維素、大米、蒜頭、茶葉做代表，以檢測限的1倍、2倍、10倍添加水平，添加7種硒形態(tài)化合物混合標準使用液，按本研究制定的方法進行檢測，在不同時間檢測6次，計算6次測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)，驗證方法的重復性。多維素、大米、蒜頭、茶葉在1倍、2倍、10倍檢測限添加水平的6次測定結(jié)果的RSD在1.62%～18.48%之間，其中被測組分含量10 μg/kg內(nèi)，6次測定結(jié)果的RSD在<18.48%；被測組分含量10 μg/kg內(nèi)，6次測定結(jié)果的RSD<12.7%。

取陰性樣品多維素、大米、蒜頭、茶葉，按以上方法添加7種硒形態(tài)化合物混合標準使用液(5、10、50 μg/kg)，按本研究制定的方法進行檢測，在不同時間檢測6次，計算回收率，驗證方法的準確度。多維素、大米、蒜頭、茶葉樣品在1倍、2倍、10倍檢測限添加水平的回收率在71.9%～116.7%之間。

2.4.2 陽性樣品進行重復性驗證取富硒酵母陽性樣品，按本研究制定的方法進行檢測，在不同時間檢測6次，計算6次測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)，驗證方法的重復性，SeCys2、 SeMeCys及SeMet含量在100 mg/kg以內(nèi)，RSD<3.56%，Se(Ⅳ) 含量在10 mg/kg以內(nèi)，RSD為6.26%，Se(Ⅵ)、SeUr、SeEt含量在1 mg/kg以內(nèi)RSD<10.45%。

2.5 樣品分析

將建立的方法用于食品中硒形態(tài)分析，其結(jié)果見表3。可以看出，除了富硒酵母外，大部分產(chǎn)品含硒都較低。富硒保健食品中的富硒酵母，其硒成分以SeMet為主；富硒糧谷類食品的硒成分以SeCys2為主；水產(chǎn)品含有一定量的硒，硒成分以SeMeCys為主。某些標為富硒產(chǎn)品，如富硒茶葉的樣品檢出的硒成分含量較低，小于標簽標注的含量；富硒蒜頭、富硒番薯、富硒玉米粉等未檢測出硒成分。

表3 市售產(chǎn)品7種硒形態(tài)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過對食品中硒形態(tài)檢測的色譜條件、質(zhì)譜條件及前處理進行優(yōu)化，建立了HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)同時檢測食品中的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、SeMeCys、SeUr、SeMet和SeEt共7種硒形態(tài)含量的分析方法。方法樣品前處理簡便快捷，試劑無毒無害，檢測特異性強、靈敏度高，定量精準，滿足食品中無機硒和多種有機硒形態(tài)分析的需要，為食品中硒形態(tài)的分析鑒定提供了切實可行的方法依據(jù)。