田耀宗， 張校亮， 譚 慷， 李曉春

(1.新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原理工大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，山西太原 030024；2.太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西太原 030024)

砷在自然界中主要以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的形式存在，其中As(Ⅲ)的毒性遠(yuǎn)高于As(Ⅴ)[1]。含砷工業(yè)廢水的不合理排放，含砷農(nóng)藥的大量使用均會(huì)對(duì)水源和土壤造成污染[2-4]。長期飲用、食用被砷污染的水和糧食會(huì)造成人體內(nèi)砷的蓄積，嚴(yán)重危害人體健康[5,6]。世界衛(wèi)生組織(WHO)要求飲用水中砷含量低于10 μg/L[7]；我國要求飲用水中砷含量低于10 μg/L[8]，所排放污水中砷含量低于0.5 mg/L[9]，土壤中砷含量低于20 mg/kg[10]。因此，對(duì)環(huán)境中的砷，尤其是As(Ⅲ)的檢測，對(duì)于環(huán)境監(jiān)測以及保障人民健康具有重要意義。目前對(duì)于As(Ⅲ)的檢測主要包括：電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)等大型儀器檢測法。這些方法具有檢測限低、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)[11]，但需要大型儀器，成本高、操作復(fù)雜，不適合快速篩查。近些年來研究者們一直在探究新的快速檢測As(Ⅲ)的方法。

核酸適配體(適配體)是一段能夠特異性地與目標(biāo)分子結(jié)合的DNA或RNA片段，與普通的抗體相比適配體具有高特異性、高親和性、靶范圍廣、篩選周期短、易修飾等特點(diǎn)[12]。由于As(Ⅲ)的適配體的發(fā)現(xiàn)[13]，基于適配體檢測As(Ⅲ)的方法陸續(xù)出現(xiàn)，其中基于As(Ⅲ)適配體-金納米粒子(Au NPs)結(jié)構(gòu)的光學(xué)檢測方法引起了眾多研究者的關(guān)注[14]。2012年，Wu等人利用As(Ⅲ)適配體與陽離子表面活性劑PDDA形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，當(dāng)待測樣品中存在As(Ⅲ)時(shí)，適配體會(huì)特異性地與As(Ⅲ)相結(jié)合，裸露的PDDA會(huì)吸引溶液中的Au NPs相互靠近發(fā)生聚集，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。通過建立溶液在波長650 nm和520 nm的吸光度比值與As(Ⅲ)濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了水中As(Ⅲ)的定量檢測，檢出限低至5.3 μg/L[15]。2019年，Matsunaga等人構(gòu)建了As(Ⅲ)適配體-Au NPs結(jié)構(gòu)，加入高濃度NaCl引起Au NPs聚集，通過溶液吸光度變化實(shí)現(xiàn)了地下水中As(Ⅲ)的檢測[16]，檢出限為0.161 mg/L。分光光度法靈敏度高，但該方法對(duì)待測樣品的體積需求量較大，溶液中未知顆粒發(fā)生散射也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響[17]。因此，Au NPs 光學(xué)信號(hào)的新型檢測方法一直是人們研究的熱點(diǎn)。

Au NPs具有良好的光熱效應(yīng)，在激光照射下，Au NPs強(qiáng)烈地吸收激光能量并將其轉(zhuǎn)化為熱量，從而引起周圍介質(zhì)溫度的上升及折射率變化，變化的幅度與其濃度和形態(tài)有關(guān)[18,19]。當(dāng)Au NPs發(fā)生聚集時(shí)，溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，其固定波長處的光熱效應(yīng)也會(huì)發(fā)生變化，而光熱引起的溶液折射率的變化可以采用激光背向散射干涉等光學(xué)方法進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、非接觸等優(yōu)點(diǎn)[20]?；谝陨涎芯?，我們提出了基于適配體-Au NPs和光熱-激光背向散射干涉(Photothermal Laser Backscattering Interference,PT-BSI)原理進(jìn)行As(Ⅲ)檢測的技術(shù)。采用波長為532 nm的綠光激光器作為光熱效應(yīng)的激發(fā)光源，待測樣品中As(Ⅲ)的濃度不同時(shí)，Au NPs聚集的程度也不同，光熱效應(yīng)導(dǎo)致溶液的折射率變化幅度就不同，表現(xiàn)為干涉條紋移動(dòng)量的不同。通過建立干涉條紋移動(dòng)量與As(Ⅲ)的濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了水中As(Ⅲ)濃度的檢測，檢出限為0.127 mg/L，可以用于排放廢水、部分地區(qū)As(Ⅲ)超標(biāo)地下水，以及土壤中As(Ⅲ)的檢測[9,10,16]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MGL-Ⅲ-532全固態(tài)激光器(長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司，100 mW)；78 HW-1數(shù)顯磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；LC100線陣CCD(THORLABS)；HC-2518高速離心機(jī)(安徽中科中加科學(xué)儀器)；TED200C溫控器(THORLABS)；TKAGenpure UV超純水系統(tǒng)(美國，賽默飛世爾公司)；TEC3-6半導(dǎo)體致冷器(THORLABS)；UV-3100紫外-可見光分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；AD590溫度傳感器(THORLABS)；石英毛細(xì)管(佰思特石英)。

As(Ⅲ)適配體5′-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG-3′(上海生工生物工程有限公司)，NaCl(≥99.5%，分子生物學(xué)級(jí)，美國Sigma-Aldrich公司)，NaAsO2(≥99%，美國Sigma-Aldrich公司)，檸檬酸三鈉(分析純，≥99%，美國Sigma-Aldrich公司)，NaBH4(98%，美國Sigma-Aldrich公司)；HAuCl4(Au：23.5%～23.8% in dilute HCl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental device

如圖1所示，激光器發(fā)射一束激光(532 nm、光束直徑3.16 mm)經(jīng)過反射鏡后，垂直入射到毛細(xì)管(內(nèi)徑0.63 mm、外徑2 mm)的檢測區(qū)域。激光在毛細(xì)管內(nèi)外界面產(chǎn)生多次反射、折射，其中一部分反射和折射光經(jīng)鏡面反射至線陣CCD處發(fā)生干涉，出現(xiàn)條紋狀的干涉圖案。通入不同濃度的As(Ⅲ) 溶液后，加入NaCl，Au NPs發(fā)生聚集，激光照射檢測區(qū)域產(chǎn)生光熱效應(yīng)導(dǎo)致檢測溶液升溫，溶液折射率發(fā)生變化，條紋狀的干涉圖案發(fā)生移動(dòng)，通過檢測線陣CCD上干涉條紋的位置變化量，可實(shí)現(xiàn)對(duì)As(Ⅲ)的定量檢測。為了避免環(huán)境溫度變化的影響，在實(shí)驗(yàn)中采用溫控器保持檢測系統(tǒng)周圍環(huán)境溫度恒定。為了進(jìn)一步提高檢測精度，本文中對(duì)條紋信息進(jìn)行傅里葉變換，從而獲取條紋移動(dòng)時(shí)對(duì)應(yīng)的相位移動(dòng)值[20]。

1.3 Au NPs溶液的制備

分別將0.5 g檸檬酸三鈉固體、0.5 g HAuCl4固體溶于兩個(gè)盛有50 mL去離子水的燒杯中，制得 1%的檸檬酸三鈉溶液及1%HAuCl4溶液。用去離子稀釋1%的HAuCl4溶液，制得0.01%的HAuCl4溶液。將0.0375 g NaBH4固體溶于盛有50 mL 1%檸檬酸三鈉溶液的燒杯中，制得0.075%的NaBH4溶液，室溫下在磁力攪拌機(jī)上將0.5 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液加入到50 mL 0.01%的HAuCl4溶液中，攪拌使之充分反應(yīng)，60 s后向混合溶液中加入1 mL 0.075%的NaBH4溶液，所得Au NPs 溶液為酒紅色，其直徑約為10 nm[21]。

1.4 As(Ⅲ)的定量檢測

分別取250 μL 濃度為2 μmol/L的適配體溶液，分別加入到8個(gè)盛有600 μL Au NPs溶液的PE管中，振蕩混合均勻得到反應(yīng)液。然后依次將130 μL 濃度為0、0.5、0.8 、1、2、5、8、10 mg/L的As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入到反應(yīng)液中混合均勻，5 min后向上述溶液中分別加入20 μL 濃度為2 mol/L 的NaCl 溶液，最后將混合液通入毛細(xì)管的檢測區(qū)域，調(diào)節(jié)激光入射功率為20 mW，采集條紋狀干涉圖案的相位移動(dòng)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NPs聚集原理

穩(wěn)定的Au NPs溶液為酒紅色，加入高濃度的NaCl后，溶液中的陽離子會(huì)中和Au NPs表面電荷，使Au NPs發(fā)生聚集，溶液變?yōu)樗{(lán)紫色[16,21]。將適配體加入到Au NPs溶液中，適體鏈可以包裹在分散的Au NPs上形成保護(hù)層，此時(shí)加入高濃度的NaCl，由于適配體的保護(hù)作用，Au NPs不會(huì)發(fā)生聚集。如圖2所示，將待測溶液加入適配體與Au NPs的混合液中，若待測液中不存在As(Ⅲ)，即使溶液中存在陽離子，Au NPs仍處于分散狀態(tài)并保持穩(wěn)定；若待測液中存在As(Ⅲ)時(shí)，Au NPs表面包裹的適配體會(huì)脫落，并與As(Ⅲ)形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，加入NaCl溶液后，Au NPs發(fā)生聚集，溶液顏色發(fā)生改變。

圖2 適配體-納米金檢測As(Ⅲ)原理圖Fig.2 Schematic illustration of As(Ⅲ) detection using aptamer-Au NPs

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 NaCl濃度分別取0、4、5、10、15、20、25 μL濃度為 2 mol/L的NaCl溶液與600 μL Au NPs溶液混合均勻，加水使溶液總體積為1 000 μL，NaCl溶液的實(shí)際濃度為0、0.008、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L，利用分光光度計(jì)測量溶液的吸收光譜，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看到，NaCl濃度越大，Au NPs逐漸發(fā)生聚集，最大吸收峰處的吸光度越低，當(dāng)加入20 μL NaCl溶液(在混合液中的實(shí)際濃度為0.04 mol/L)后，吸收峰的吸光度不再下降，因此，實(shí)驗(yàn)中我們選取20 μL濃度為2 mol/L的NaCl溶液。

2.2.2 適配體濃度分別移取0、50、100、150、200、250 μL的濃度為2 μmol/L的As(Ⅲ)適配體溶液與600 μL Au NPs溶液混合均勻，靜置5 min后，分別向上述混合液中加入“2.2.1”所述優(yōu)化的最佳濃度的NaCl溶液，加水使溶液總體積為1 000 μL(混合液中適配體實(shí)際濃度為0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5 μmol/L)混合均勻，測量不同濃度適配體下溶液的吸收光譜，如圖4所示。從圖可以看到，當(dāng)適配體濃度為0時(shí)，加入NaCl，最大吸收峰處的吸光度最低，長波長處的吸光度增加，表明Au NPs之間發(fā)生聚集。當(dāng)適配體溶液濃度越來越高時(shí)，表面形成適配體保護(hù)層的Au NPs越來越多，其最大吸收峰值不斷增高，當(dāng)加入250 μL適配體溶液后(對(duì)應(yīng)濃度為0.5 μmol/L)，最大吸收峰處吸光度不再增高，說明此時(shí)Au NPs被完全包裹，因此實(shí)驗(yàn)中我們選取250 μL 濃度為2 μmol/L的適配體溶液(在混合液中實(shí)際濃度為0.5 μmol/L)。

圖3 加入不同濃度NaCl溶液后Au NPs溶液的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of Au NPs with different concentrations of NaCl

圖4 適配體濃度不同時(shí)加入NaCl溶液后Au NPs溶液的吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of Au NPs in solutions with different aptamer concentrations after NaCl solution added

2.3 基于光熱-激光背向散射干涉(PT-BSI)的As(Ⅲ)定量檢測

依次取“1.4”所述的As(Ⅲ)、適配體、Au NPs和NaCl組成的混合液20 μL，通入毛細(xì)管中，打開激光器，調(diào)節(jié)激光入射功率為20 mW，使得激光照射毛細(xì)管檢測區(qū)域225 s，觀察干涉條紋相對(duì)于初始時(shí)刻的變化。由于激光器的發(fā)射波長為532 nm，接近Au NPs的吸收峰，激光照射檢測區(qū)域產(chǎn)生光熱效應(yīng)導(dǎo)致檢測溶液升溫，溶液折射率發(fā)生改變，條紋狀的干涉圖案發(fā)生移動(dòng)。我們將某時(shí)刻干涉條紋的相位值相對(duì)于初始時(shí)刻相位值的差值定義為該時(shí)刻的PT-BSI相位變化值信號(hào)(rPT-BSI signal)，并記錄不同時(shí)刻的rPT-BSI signal數(shù)據(jù)。如圖5(A)所示，由于光熱作用，隨著激光照射時(shí)間的增加， rPT-BSI signal逐漸增大，最后達(dá)到穩(wěn)定。我們將穩(wěn)定后的PT-BSI相位變化值作為該溶液的最終有效的PT-BSI相位變化值信號(hào)(ePT-BSI signal)，并建立As(Ⅲ)濃度與ePT-BSI signal關(guān)系(圖5(B))

從圖4及圖5(A)可以看到，隨著溶液中As(Ⅲ)濃度的增大，激光波長處的吸光度逐漸降低，光熱效應(yīng)減弱，其ePT-BSI signal逐漸減小。圖5(B)給出了0～10 mg/L范圍內(nèi)的不同濃度As(Ⅲ)的相位變化值信號(hào)ePT-BSI signal。由圖可知，ePT-BSI signal隨As(Ⅲ)濃度的增大而減小，兩者呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9939，靈敏度為0.021 rad/(mg·L-1)，計(jì)算所得檢出限(3σ)為0.127 mg/L。

圖5 (A)不同濃度 As(Ⅲ)溶液的rPT-BSI signal與時(shí)間的關(guān)系；(B)ePT-BSI signal與As(Ⅲ) 濃度的關(guān)系Fig.5 (A) Relationship between rPT-BSI signal and time for different concentrations of As(Ⅲ);(B) Relationship between ePT-BSI signal and As(Ⅲ) concentration

雖然127 μg/L遠(yuǎn)高于飲用水中的As(Ⅲ)需低于10 μg/L的限定，但該方法可用于排放廢水、部分地區(qū)As(Ⅲ)超標(biāo)地下水，以及土壤中As(Ⅲ)的檢測[9,10,16]。此外，若將實(shí)驗(yàn)中所用激光器的功率適當(dāng)增大，還可以進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，并降低檢出限。

2.4 As(Ⅲ)檢測的選擇性

圖6 As(Ⅲ) 檢測方法的選擇性Fig.6 The selectivity test for the detection of As(Ⅲ)

為了驗(yàn)證本方法的抗干擾性能，研究了常見的金屬離子對(duì)As(Ⅲ)的干擾情況。配制2 mg/L的As(Ⅲ)、Ni2+、Na+、Ca2+、Fe(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)、Cu2+溶液。分別將250 μL濃度為2 μmol/L的As(Ⅲ)適配體溶液與600 μL Au NPs混合均勻，然后分別加入130 μL濃度為2 mg/L的上述金屬離子溶液，振蕩后靜置5 min使之充分反應(yīng)，最后加入20 μL的2 mol/L的NaCl溶液。依次取20 μL混合溶液通入毛細(xì)管中，打開激光器進(jìn)行檢測。為了便于比較，我們將空白溶液的ePT-BSI signal與每個(gè)樣品的ePT-BSI signal的差值作為檢測信號(hào)，即ΔePT-BSI signal，結(jié)果如圖6所示。由圖可以看出，As(Ⅲ) 的信號(hào)最強(qiáng)，而以上幾種常見離子的信號(hào)較弱，對(duì)As(Ⅲ)的檢測影響較小。說明本方法具有良好的選擇性。

2.5 加標(biāo)水樣的檢測

為了驗(yàn)證該檢測方法的可靠性，對(duì)加標(biāo)自來水水樣中As(Ⅲ)進(jìn)行了檢測。配制As(Ⅲ)濃度分別為 0.50、0.80、1.0、5.0 mg/L水樣(純自來水中未檢出As(Ⅲ))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加標(biāo)樣品檢測出As(Ⅲ)濃度分別為0.538、 0.809、 1.05、 4.96 mg/L，回收率分別為107.6%、101.1%、105.0%、99.2%。表明本方法可以用于部分嚴(yán)重超標(biāo)水的檢測。若提前對(duì)樣品進(jìn)行一定的預(yù)處理，方法還可以用于排放廢水以及土壤中As(Ⅲ)的檢測。

3 結(jié)論

本文研究了一種基于適配體-金納米粒子結(jié)構(gòu)的探針和光熱-激光背向散射干涉技術(shù)的As(Ⅲ)定量檢測方法。金納米顆粒和As(Ⅲ)可以與其適配體競爭性結(jié)合，導(dǎo)致As(Ⅲ)適配體從金納米顆粒表面脫落，在高濃度鹽作用下發(fā)生聚集，造成溶液在激光波長處的光熱效應(yīng)發(fā)生變化，通過檢測激光背向散射干涉條紋的移動(dòng)信息，實(shí)現(xiàn)了As(Ⅲ)的定量檢測。此外，該方法還可用于涉及普通顯色反應(yīng)的目標(biāo)物檢測中。因此，本方法具有快速、微體積、普適性廣等優(yōu)點(diǎn)。