李 躍 劉 娜 宋 瑩 張季軍 李 紅 肖千明

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110161）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）屬子囊菌門，肉座菌目，蟲(chóng)草科，蟲(chóng)草屬，又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草，是蟲(chóng)草屬的模式種[1]。研究證明，蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸及多糖等特殊活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等諸多生理功效，被用作冬蟲(chóng)夏草的替代品[2]。酯酶同工酶是食用菌種質(zhì)資源研究的生化指標(biāo)之一，可反映出生物間的遺傳信息和進(jìn)化關(guān)系，可作為傳統(tǒng)生物學(xué)分類的輔助依據(jù)[3]。筆者用酯酶同工酶技術(shù)對(duì)12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為蛹蟲(chóng)草菌種管理和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

供試的12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株采用組織分離獲得，編號(hào)為C1～C12。

固體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL。

液體菌種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，蛋白胨3 g，牛肉膏5 g，水1 000 mL。

表1 供試蛹蟲(chóng)草菌株編號(hào)及來(lái)源

栽培種培養(yǎng)基配方：每瓶裝40 g小麥，加入營(yíng)養(yǎng)液60 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)特性試驗(yàn)

用直徑6 mm 打孔器取活化后的菌種塊接種于直徑9 cm 的固體培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)（23±1）℃避光培養(yǎng)。觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)以及菌絲轉(zhuǎn)色后的顏色，并計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度[4]。

菌絲平均長(zhǎng)速（mm/d）=（[菌落直徑-6）÷2]÷培養(yǎng)時(shí)間

1.2.2 收集菌絲

將活化后的菌種在無(wú)菌條件下接入20 mm×200 mm的試管中，每個(gè)菌株8支，置于（23±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿試管后將菌絲慢慢刮下，注意菌絲不帶有培養(yǎng)基，以免影響后期的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。每個(gè)菌株取0.5 g菌絲，-20 ℃冰凍24 h后備用[5]。

1.2.3 同工酶電泳

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。將收集的菌絲放入液氮中研磨，并加入0.5 mL 的提取液，研磨后將樣品收集于1.5 mL離心管中，14 938×g離心20 min，取上清液。將上清液與蔗糖溶液按體積比1∶1 混合作為電泳樣品，點(diǎn)樣量45 μL，溴酚藍(lán)作為指示劑。4 ℃電泳，初始電壓為100 V/板，進(jìn)入分離膠后電壓為150 V/板。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移距末端1 cm左右時(shí)，停止電泳，染色并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶譜分析

測(cè)量相對(duì)遷移率（Rf）：相對(duì)遷移率Rf=X/Y，X為點(diǎn)樣孔下沿到指示劑前沿的遷移距離，Y為點(diǎn)樣孔下沿到凝膠中酶帶的遷移距離[6]。

菌株間聯(lián)合系數(shù)（S）分析：兩個(gè)菌株之間共同具有的酶帶數(shù)與兩菌株所具有的酶帶數(shù)之和減去共有酶帶數(shù)的比值。S=c（/a+b-c），式中，a和b分別為菌株各自的酶帶總數(shù)，c為a、b菌株共有的酶帶數(shù)[7-8]。

聚類分析：在相同遷移率位置上，有酶帶記為1，無(wú)酶帶記為0，并用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行聚類分析[9]。

1.2.5 出草比較試驗(yàn)

栽培容器為750 mL 透明罐頭瓶，每個(gè)菌株接種100 瓶。子實(shí)體成熟后，供試的12 個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株分別隨機(jī)選取20瓶，觀察子實(shí)體顏色，測(cè)定鮮重、干重等，考察蛹蟲(chóng)草子實(shí)體農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試蛹蟲(chóng)草菌株菌絲培養(yǎng)特性

由表2 可以看出，菌絲平均長(zhǎng)速最快的是C6，其次是 C1，最慢的是 C11；C3、C9、C10 菌絲體濃密，C1、C2、C5、C6、C7、C8 菌絲體較濃密，C4、C11、C12 菌絲體??；C3、C9、C10 為氣生菌絲且旺盛，C7也為氣生菌絲，其他菌株都是匍匐菌絲；大部分菌株菌絲是橙黃色，只有C2、C3、C11 是淺黃色。

表2 供試12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株菌絲生長(zhǎng)情況

2.2 供試蛹蟲(chóng)草菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀

由表3 可以看出，多數(shù)菌株子實(shí)體顏色是橙黃色，只有C2、C3、C8、C11 是橘黃色。子實(shí)體干重依次為C6＞C1＞C5＞C4＞C2＞C8＞C12＞C9＞C7＞C10＞C3＞C11，鮮品較重的是 C6、C1。C1、C2、C4、C5、C6、C8 菌株子實(shí)體整齊，C3、C7、C9、C10、C11 菌株子實(shí)體不整齊，C12 子實(shí)體較整齊。C1、C11 菌株子實(shí)體形態(tài)為尖頭，C2、C8菌株為孢子頭，其他菌株為棒狀。

圖1 供試12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株子實(shí)體形態(tài)

表3 供試12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株農(nóng)藝性狀比較

2.3 酯酶同工酶酶帶分析

由圖2、圖3 及表4 可以得出，所有菌株共分離出49 條酶帶。按其電泳遷移率（Rf）集中程度由負(fù)極向正極可分為A、B 兩個(gè)區(qū)，各菌株有2～5 條不同的酶帶，多數(shù)為 4～5 條，Rf在 0.178～0.680，其中 A 區(qū)Rf在0.178～0.296，B區(qū)Rf在0.538～0.680。

圖2 供試蛹蟲(chóng)草菌株的酯酶同工酶圖譜

圖3 供試蛹蟲(chóng)草菌株的酯酶同工酶模式圖

表4 供試12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株同工酶的譜帶Rf值

12 個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株中部分菌株酶帶基本相同，只是酶帶深淺寬窄有所不同，這可能與酶濃度、酶活性有關(guān)[10]。在A 區(qū)中共有15 條酶帶，酶帶顏色淺，說(shuō)明酶的活性弱。B 區(qū)中共有34 條酶帶，在Rf為0.538、0.550 處酶帶較深，在Rf為 0.601～0.680 處酶帶最深，說(shuō)明酶的活性強(qiáng)。在 A 區(qū)，C9、C10 在Rf為0.178 處有相同的酶帶；C2、C11、C12 在Rf為 0.237處有相同的酶帶；除了C2、C11，其他菌株在Rf為0.296處都有相同的酶帶。在B區(qū)，多數(shù)菌株在Rf為0.538、0.601、0.630 處有相同的酶帶，說(shuō)明這些菌株之間有同源性，在主要代謝過(guò)程中具有相似的生理性 狀[10]。C1 有 2 條 特 殊 酶 帶 ，Rf分 別 為 0.550、0.604；C2 有 2 條特殊酶帶，Rf分別為 0.621、0.645；C8 有1 條特殊酶帶Rf為0.680，說(shuō)明這三個(gè)菌株與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 菌株間親緣關(guān)系分析

由相對(duì)遷移率可以看出各菌株間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為了更直觀，利用聯(lián)合系數(shù)（S）可更清楚地反映供試菌株間的親緣關(guān)系。由表5 可見(jiàn)，12 個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株的遺傳聯(lián)合系數(shù)在0～1 變化，兩個(gè)菌株間聯(lián)合系數(shù)越小，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聯(lián)合系數(shù)越大，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系越近[11]。其中菌株C1 與C2、C11 之間，C2 與 C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10 之間，菌株C11 與C1、C3、C4、C5、C6、C7、C9、C10 之間S 為0，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；菌株C3、C4、C5、C6、C7 之間，C9 與 C10 之間 S 為 1，它們都有 4 條酶帶，位置相同，寬窄不同，顏色深淺稍有差異，說(shuō)明親緣關(guān)系十分相近。

2.5 酯酶同工酶聚類分析

由圖4 可以看出，所有菌株在聚類為0.58 處分為4個(gè)類群：第1個(gè)類群為C1，與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；第2 個(gè)類群包括 C3、C4、C5、C6、C7、C9、C10、C12、C8，其中C3、C4、C5、C6、C7 相異系數(shù)（距離系數(shù)）為0，C9與C10相異系數(shù)為0，說(shuō)明每組菌株的遺傳背景相似或?yàn)橥痪?；?個(gè)類群為C2；第4個(gè)類群為C11。在聚類為0.78 時(shí)，菌株C1 與第2 個(gè)類群歸為一類；C2、C11 歸為一類，說(shuō)明菌株 C1、C2、C11與其他類群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 供試蛹蟲(chóng)草菌株的聚類分析

表5 供試12個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株同工酶的聯(lián)合系數(shù)（S）

3 小結(jié)與討論

菌絲長(zhǎng)勢(shì)包括菌絲生長(zhǎng)的狀態(tài)和速度。優(yōu)良菌種菌絲長(zhǎng)速正常、整齊、濃密、健壯；劣質(zhì)菌種菌絲生長(zhǎng)緩慢、稀、參差不齊、易衰老[12]。供試12 個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲密度和菌絲形態(tài)有一定差異，在生產(chǎn)中匍匐狀菌絲更有利于現(xiàn)蕾；這與秦俊哲的菌株活力較強(qiáng)能出草，其菌絲基本都為白色圓環(huán)匍匐狀的研究結(jié)果相一致[13]；子實(shí)體鮮品、干品較重的為C6、C1 菌株，C1、C2、C4、C5、C6、C8 菌株子實(shí)體整齊，子實(shí)體的整齊度直接影響到干品的外觀。C1、C11 是尖頭，C2、C8 是孢子頭，其他菌株都是棒狀。綜合比較表現(xiàn)突出的是菌株C6、C1。

酯酶同工酶分析彌補(bǔ)了以子實(shí)體形態(tài)等特征分類方法的不足[14]。試驗(yàn)酯酶同工酶酶帶分析共檢測(cè)出49條酶帶，Rf在0.178～0.680，從中可以看出，尖頭菌株C1、野生菌株C11、孢子頭菌株C2 與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；C3、C4、C5、C6、C7 菌株相異系數(shù)為0，菌株C9 與C10 相異系數(shù)為0，說(shuō)明沈陽(yáng)當(dāng)?shù)赜枷x(chóng)草種質(zhì)資源并不豐富，多為相似或?yàn)橥痪辏毙柽x育新品種，這與何華奇收集的4 株沈陽(yáng)蛹蟲(chóng)草菌株，遺傳相似系數(shù)也在0.88 以上結(jié)果基本一致[15]。聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征分析結(jié)果基本一致，而聚類分析、同工酶酶譜結(jié)果更為直觀、客觀和規(guī)范。