李 嘉，彭慧云，劉曉燕，陳耀武

(1.南華大學(xué)附屬長沙市中心醫(yī)院 兒科，湖南 長沙410000；2.郴州市第一人民醫(yī)院 手足顯微外科)

維生素D缺乏性佝僂病是一種因維生素D缺乏，導(dǎo)致新骨鈣化障礙的慢性營養(yǎng)性疾病，發(fā)病率很高[1]。骨化三醇是維生素D3經(jīng)肝臟和腎臟羥化酶代謝的1，25-二羥代謝物，能快速補(bǔ)充患兒體內(nèi)的維生素D，為治療維生素D缺乏性佝僂病常規(guī)藥物[2-3]。但該疾病發(fā)病隱匿且常規(guī)治療周期較長，導(dǎo)致部分患兒未能及時(shí)且充分的得到治療，延誤病情，影響患兒的生長發(fā)育。因此，探明骨化三醇對(duì)骨轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響，將有助于進(jìn)一步理解骨化三醇的藥物作用，為臨床的輔助用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。硬骨素(SOST)是一種由骨細(xì)胞分泌的且抑制骨形成的蛋白，反映骨細(xì)胞的活性和數(shù)量；I型前膠原氨基端原肽(PINP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)，它們分別是成骨和破骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物，反映成骨和破骨細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)[4-6]。以上這些因子皆可不同程度的調(diào)節(jié)機(jī)體骨轉(zhuǎn)換水平。本研究通過檢測(cè)骨化三醇治療前后的維生素D缺乏性佝僂病患兒血清SOST、PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b、25-(OH)D濃度，明確骨化三醇對(duì)骨轉(zhuǎn)換的影響。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

選取2015年5月至2017年6月來南華大學(xué)附屬長沙市中心醫(yī)院兒科就診的符合維生素D缺乏性佝僂病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]的62名，隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組31例，男16例，女15例，年齡1歲-3歲。骨化三醇組31例，男17例，女14例，年齡1歲-3歲。兩組患兒的年齡、性別、血清25-(OH)D濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。對(duì)照組給與口服維生素D2治療，骨化三醇組給與口服骨化三醇治療，治療時(shí)間為1個(gè)月。排除近期有大量維生素D或激素類藥物應(yīng)用史、先天性疾病等情況的患兒。經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書后進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

分別抽取治療前后空腹靜脈血4 ml，4℃冰箱中靜置12 h至血清析出，3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，用移液槍吸取一定量的上層血清凍于-80℃冰箱中待測(cè)。檢測(cè)前，標(biāo)本提前30 min復(fù)溫。采用英國IDS公司的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)血清中25-(OH)D的濃度；采用美國R&D公司的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中SOST的濃度。采用武漢伊萊瑞特生物科技公司的ELISA試劑盒檢測(cè)血清PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本情況及用藥情況

根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)共納入62例維生素D缺乏性佝僂病患兒，分成兩組，對(duì)照組和骨化三醇組。對(duì)照組患兒每天口服2000 IU維生素D2，骨化三醇組患兒每天口服0.25 μg骨化三醇。對(duì)照組31例，平均年齡(2.1±0.8)歲，給藥前血清25-(OH)D濃度為42.2±3.8 nmol/L，給藥后為96.2±17.1 nmol/L。骨化三醇組31例，平均(1.9±0.9)歲，給藥前血清25-(OH)D濃度為41.6±4.1 nmol/L，給藥后為136.1±22.4 nmol/L。

2.2 兩組治療前后血清SOST及骨代謝指標(biāo)水平比較

給藥后兩組的血清SOST、PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b水平顯著高于給藥前，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥后，骨化三醇組血清SOST、PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b水平顯著高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后血清SOST及骨代謝指標(biāo)水平的比較

2.3 兩組治療前后的血清SOST水平與血清骨代謝指標(biāo)、25-(OH)D水平的相關(guān)性分析

給藥前，SOST與BGP和25-(OH)D呈正相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.58，r=0.66；P<0.05)，與PINP、CTX-I和TRAP-5b呈負(fù)相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.35，r=-0.76，r=-0.29；P<0.05)；給藥后，骨化三醇組SOST與PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b、25-(OH)D呈正相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.72，r=0.61，r=0.35，r=0.39，r=0.58；P<0.05)。

3 討論

維生素D缺乏性佝僂病又叫骨軟化癥，是一種由于機(jī)體缺乏維生素D導(dǎo)致新骨礦化不足的慢性營養(yǎng)性疾病，發(fā)病緩慢，嚴(yán)重影響患兒的生長發(fā)育，在我國發(fā)病率較高[8,9]。目前，針對(duì)該疾病的藥物治療以補(bǔ)充鈣劑和維生素D為主，骨骼畸形者輔以矯形療法[10]。維生素D的活性形式骨化三醇(又稱為1，25-二羥維生素D3)，因其可以直接快速的補(bǔ)充患兒體內(nèi)的維生素D，是治療維生素D缺乏性佝僂病最常用的藥物[2]。但由于該疾病發(fā)病隱匿且常規(guī)治療周期較長，使得部分患兒未能及時(shí)且充分的得到治療，導(dǎo)致病情延誤。因此，除加強(qiáng)對(duì)疾病的早期診斷外，加速藥物治療周期也具有十分重要的意義。而聯(lián)合用藥可達(dá)此目的。本研究通過比較骨化三醇治療前后血清SOST、骨代謝指標(biāo)水平的變化情況，以期探明骨化三醇對(duì)骨轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步理解骨化三醇的藥物作用和臨床聯(lián)合用藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

骨化三醇既是維生素D的活性形式，也是體內(nèi)的一種激素，對(duì)血清鈣、磷濃度的調(diào)節(jié)十分重要[11]。它能夠加速鈣結(jié)合蛋白的合成，從而使得腸道吸收鈣質(zhì)。同時(shí)，它還能夠增加破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)前者的效應(yīng)要高于后者[11]。但其對(duì)維生素D缺乏性佝僂病患兒血清SOST及骨代謝相關(guān)指標(biāo)水平的影響至今尚不明確。SOST主要是由骨細(xì)胞分泌，在骨組織代謝更新過程中起著十分重要的作用，可反映骨細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)[12]。Van Bezooijen等[13]研究表明，骨細(xì)胞特異性表達(dá)的SOST通過與Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游受體LRP5/6結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin通路信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制骨形成。目前，SOST單克隆抗體已獲FDA批準(zhǔn)上市，用于治療絕經(jīng)后女性伴高骨折風(fēng)險(xiǎn)的骨質(zhì)疏松癥。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏性佝僂病患兒血清SOST濃度顯著降低。只由成骨細(xì)胞合成和分泌的Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)和骨鈣素(BGP)是成骨細(xì)胞表型標(biāo)志物，PINP可直接反映骨組織中膠原合成水平，BGP可直接反映骨組織的礦化水平[5]。張會(huì)豐等[14]報(bào)道維生素D缺乏性佝僂病患兒的血清PINP濃度顯著高于正常兒童，而其血清BGP濃度則顯著低于正常兒童。骨基質(zhì)中絕大部分是膠原蛋白，其中以Ⅰ型骨膠原最多，Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX-I)是Ⅰ型骨膠原的降解產(chǎn)物；抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)是其中一種來源于破骨細(xì)胞的酸性磷酸酶[5]。CTX-I和TRAP-5b皆可反映破骨細(xì)胞活性和功能狀態(tài)。譚春秋等[15]報(bào)道維生素D缺乏性佝僂病患兒血清CTX-I和TRAP-5b含量顯著增加，且嬰兒顯著高于幼兒。綜上可知，維生素D缺乏性佝僂病患兒骨代謝水平呈現(xiàn)負(fù)反饋性的升高，但礦化不足。

本研究發(fā)現(xiàn)維生素D和骨化三醇皆可增加維生素D缺乏性佝僂病患兒血清SOST、PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b、25-(OH)D濃度，同時(shí)骨化三醇治療組的患兒各血清指標(biāo)濃度顯著高于維生素D治療組。提示我們維生素D及骨化三醇皆可增加佝僂病患兒的骨代謝和骨礦化水平，但骨化三醇作用更強(qiáng)。曹燕明等[16]報(bào)道絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清SOST濃度在唑來膦酸治療后的早期急劇升高，其濃度變化與PINP、CTX-I的濃度變化呈負(fù)相關(guān)。唑來膦酸主要是通過抑制骨吸收發(fā)揮作用。而唑來膦酸治療后SOST濃度變化與PINP變化呈負(fù)相關(guān)，他們認(rèn)為可能和SOST抑制骨形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，給藥前，SOST與BGP和25-(OH)D顯著正相關(guān)，與PINP、CTX-I和TRAP-5b顯著負(fù)相關(guān)，這與我們前述的結(jié)論相一致；給藥后，骨化三醇組SOST與PINP、BGP、CTX-I、TRAP-5b、25-(OH)D顯著正相關(guān)，提示我們骨化三醇顯著促進(jìn)患兒的骨形成和骨吸收，且其促成骨能力要顯著強(qiáng)于SOST抑成骨作用。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用骨化三醇治療維生素D缺乏性佝僂病的過程中，血清SOST、CTX-I、TRAP-5b水平皆顯著升高，負(fù)性調(diào)控骨的形成。因此，臨床上可嘗試運(yùn)用SOST單克隆抗體和(或)骨吸收抑制劑與骨化三醇聯(lián)合用藥，提升骨量增長速率，縮短藥物使用周期，從而增加患兒醫(yī)從性，進(jìn)而提升治愈率。