孟立立

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 先心病科，遼寧 沈陽(yáng)110016)

心力衰竭(heart failure,HF)是多種循環(huán)科疾病的終末階段，臨床表現(xiàn)為心室收縮和(或)舒張功能障礙，導(dǎo)致體循環(huán)瘀血、肺靜脈瘀血以及多臟器灌注不足，引起的以循環(huán)障礙為主的癥候群[1]。目前全球心力衰竭患者約2250萬(wàn)，其中我國(guó)心力衰竭患者比重較大，發(fā)病率約為0.9%-1.4%，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此有效針對(duì)其發(fā)病機(jī)制予以防治具有重要意義[2]。目前已知心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR) 是CHF發(fā)生發(fā)展的主要病理變化，即心室肌細(xì)胞的纖維樣改變，導(dǎo)致心室肌僵硬度增加，引起心室收射血功能障礙[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)枸杞子提取物——枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide LBP)具有抑制氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，LBP對(duì)鹽酸異丙腎上腺素(IOS)導(dǎo)致的CHF大鼠心功能具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制有待證實(shí)，TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡的重要細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞損傷和修復(fù)、免疫功能等具有重要作用[4]。目前已證實(shí)，TGF-β1 通路在心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷修復(fù)及重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Smads蛋白是 TGF-β1信號(hào)通路重要的下游調(diào)節(jié)因子，TGF-β1與其受體結(jié)合后磷酸化并激活Smads蛋白，后者可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)，最終誘導(dǎo)纖維化[5]。本研究以慢性心力衰竭大鼠為研究對(duì)象，觀察枸杞多糖對(duì)其心臟功能的改善作用，初步探討TGFβ1/ Smad3 通路在其中的調(diào)控機(jī)制，為臨床心力衰竭防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠30只， 體質(zhì)量250-300 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)-2013-0001，使用許可證號(hào)：SYXK(遼)-2013-0007)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在符合相應(yīng)資質(zhì)與條件設(shè)施中飼養(yǎng)，以便充足食水供應(yīng)并確保自由取食，光照等環(huán)境條件模擬自然情況。根據(jù)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)要求，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均需適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，構(gòu)建CHF大鼠動(dòng)物模型應(yīng)用腹主動(dòng)脈縮窄法，將模型構(gòu)建成功的CHF大鼠隨機(jī)分為心力衰竭模型組(CHF組，n=10)、枸杞多糖+心力衰竭模型組(LBP組，n=10)，另構(gòu)建假手術(shù)組(sham組，n=10)。

1.2 慢性心力衰竭大鼠模型制備[6]

大鼠腹腔注射麻醉后，密切關(guān)注大鼠生命體征變化，避免麻醉過(guò)深引起呼吸抑制而死亡。將大鼠胸腹部備皮后仰臥位固定于無(wú)菌小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，常規(guī)連接監(jiān)護(hù)儀，待大鼠生命體征平穩(wěn)后術(shù)區(qū)消毒，左上腹縱行切開(kāi)皮膚，逐層剝離肌層，充分暴露雙腎及腹主動(dòng)脈，應(yīng)用27G注射針頭將雙腎動(dòng)脈遠(yuǎn)端約0.5 cm處與腹主動(dòng)脈一同結(jié)扎，待拔出注射針頭后，可實(shí)現(xiàn)主動(dòng)脈狹窄約55%-60%，全程監(jiān)測(cè)生命體征，最后逐層閉合腹腔。sham組大鼠區(qū)別在于暴露腹主動(dòng)脈后不予以結(jié)扎。盡量保證在相同實(shí)驗(yàn)條件下建模，確保組間均衡。成功實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模后予枸杞多糖溶液灌胃，枸杞多糖溶液滴定濃度為100 mg·kg-1，將該實(shí)驗(yàn)組歸為枸杞多糖+心力衰竭模型組(LBP 組)，單純心力衰竭模型組(CHF組)及假手術(shù)組(sham組)以同等劑量蒸餾水灌胃，各組持續(xù)給藥時(shí)間8周。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢查

枸杞多糖加心力衰竭模型組(LBP 組)、心力衰竭模型組(CHF組)及假手術(shù)組(sham組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物干預(yù)處理結(jié)束后，采用乙醚吸入麻醉方式將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉，充分暴露大鼠胸部，超聲心動(dòng)儀選用飛利浦公司CX-50，探頭型號(hào)為S-12-4，頻率4-12 MHz。測(cè)定左心室舒張期末徑(left ventricular internal dimension diastole LVDD)、左心室收縮期末徑(left ventricular internal dimension systole LVDS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction LVEF)、左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(Left ventricular short axis shortening fraction LVFS)。超聲均由具有操作資質(zhì)同一單人實(shí)施，各實(shí)驗(yàn)組測(cè)量結(jié)果連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.4 心臟標(biāo)本采集與檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組在體干預(yù)及相關(guān)檢查結(jié)束后處死大鼠，解剖并暴露心臟，通過(guò)右心耳入路，左心室注射預(yù)冷生理鹽水灌流后，剝離心臟，擦干多余水份，剝離全心、右心室及左心室，分析天平分別稱取質(zhì)量并計(jì)算右心指數(shù)(right ventricular mass index，RVMI) 及左心指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)，最后取部分左心室心肌組織采用中性福爾馬林溶液固定，部分置于-80℃冰箱中保存用于病理學(xué)實(shí)驗(yàn)以及免疫組化、免疫印記等進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4.1HE染色 取福爾馬林溶液固定后的左室心肌組織，PBS溶液沖洗后，經(jīng)梯度酒精脫水，透明、包埋、切片，貼片，烤片等常規(guī)程序，分別蘇木精染色5分鐘，1%鹽酸酒精分色5 s，氨水沖洗反藍(lán)1 min，蒸餾水沖洗30 s，經(jīng)伊紅染液30 s，PBS溶液沖洗后，封片光鏡下觀察。

1.4.2Masson染色 心臟組織脫蠟、脫水后置于Regaud蘇木素液染5 min；梯度酒精脫水等流程封片，行光鏡觀察。

1.4.3Western blot 裂解心肌組織，勻漿，離心取上清，蛋白定量，行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入抗TGF-β1、 Smad3、p-Smad3、膠原蛋白 I、膠原蛋白 Ⅲ一抗，4℃冰箱中孵育過(guò)夜，加二抗，孵育。蛋白條帶行吸灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心臟超聲檢查

超聲心動(dòng)圖是臨床上評(píng)價(jià)心臟功能及結(jié)構(gòu)改變的常用方法，本研究收集各組大鼠心臟功能及結(jié)構(gòu)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)枸杞多糖對(duì)CHF大鼠心功能的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果如圖1所示，與sham組相比，CHF組LVDD、LVDS顯著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著降低(P<0.05)，提示CHF大鼠模型構(gòu)建成功。經(jīng)枸杞多糖干預(yù)后，心衰大鼠LVDD、LVDS顯著降低(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LBP可以改善CHF介導(dǎo)心臟功能障礙。

圖1 各組大鼠 LVDD、LVDS、LVEF及LVFS 結(jié)果

2.2 LVMI及RVMI情況

RVMI、LVMI是評(píng)價(jià)心臟心室結(jié)構(gòu)改變的重要手段，本研究稱取各組大鼠全心、左室及右室質(zhì)量，并計(jì)算各組大鼠RVMI及LVMI來(lái)評(píng)價(jià)各組大鼠心室重構(gòu)現(xiàn)象，結(jié)果如圖2所示，與sham組相比，CHF組RVMI、 LVMI均顯著升高(P<0.05)，枸杞多糖可以顯著降低RVMI、LVMI(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與超聲結(jié)果一致，均提示LBP可以明顯改善CHF介導(dǎo)的心室重構(gòu)。

圖2 各組大鼠LVMI及RVMI結(jié)果

2.3 HE染色

HE染色觀察心肌組織可見(jiàn)sham組大鼠細(xì)胞排列有序、規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯細(xì)胞損傷；CHF組大鼠細(xì)胞腫脹，細(xì)胞邊界模糊不清，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，與 CHF組相比，LBP組大鼠心肌細(xì)胞損傷程度明顯改善。以上結(jié)果提示LBP可改善CHF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，見(jiàn)圖3。

圖3 HE染色結(jié)果(×200)

2.4 Masson染色

心機(jī)膠原蛋白沉積是導(dǎo)致心室僵硬度增加的主要病理因素，我們采用Masson染色觀察各組大鼠心室肌纖維化程度，結(jié)果提示CHF組大鼠心肌組織中大量膠原纖維蛋白沉積，心肌纖維化程度較重；經(jīng)LBP干預(yù)后，大鼠心肌組織中僅見(jiàn)少量膠原纖維蛋白沉積，纖維化程度較CHF組明顯減輕，提示LBP可顯著改善CHF大鼠心室肌纖維化程度，見(jiàn)圖4。

圖4 Masson染色結(jié)果(×200)

2.5 Western blot

TGF-β1/Smads信號(hào)通路是重要的纖維化調(diào)節(jié)因子，既往研究表明，TGF-β1/Smads通路激活會(huì)促進(jìn)膠原纖維蛋白的沉積，參與心室重構(gòu)的進(jìn)展[17]。為明確枸杞多糖對(duì)CHF大鼠的調(diào)控機(jī)制，我們利用Western blot檢測(cè)心肌組織中TGF-β1、Smad3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達(dá)，結(jié)果與sham組相比，CHF組大鼠心肌組織中TGF-β1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，Smad3磷酸化水平增強(qiáng)，而枸杞多糖可以顯著下調(diào)TGF-β1、collagen I和collagen Ⅲ 表達(dá)，抑制Smad3磷酸化水平(P<0.05)，提示LBP能夠改善CHF大鼠心功能，抑制心室重構(gòu)進(jìn)展，,其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smads通路活性有關(guān)。

3 討論

心力衰竭常發(fā)生于心血管疾病的終末期，可導(dǎo)致嚴(yán)重的循環(huán)功能障礙(circulatory dysfunction PICD)，異常的容量及壓力負(fù)荷可導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)及心肌順應(yīng)性改變，進(jìn)而引起心臟射血功能及舒張功能障礙、心排血量減少，機(jī)體組織及細(xì)胞代謝功能紊亂。因此，預(yù)防VR的病理進(jìn)展、提高心臟射血及舒張功能是改善HF患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)以壓力負(fù)荷型CHF大鼠為研究對(duì)象，探討枸杞多糖的調(diào)控作用，結(jié)果表明，LBP可顯著改善CHF大鼠心肌纖維化進(jìn)展，提高大鼠心功能，改善心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制心肌膠原蛋白沉積、抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)。

枸杞多糖作為枸杞子中的有效成分，具有清除自由基、增強(qiáng)氧化酶活性、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高機(jī)體抗氧化能力等功能[7]。有研究證實(shí)，在缺血缺氧條件下，LBP對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有同樣的保護(hù)作用。Lu等人以心肌缺血再灌注損傷(IR)大鼠為研究對(duì)象，觀察LBP對(duì)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBP可以顯著降低IR大鼠心肌LD水平，提高Na+-K+- ATP酶和Ca2+- ATP酶活性，此外，LBP可顯著下調(diào)Bax水平，抑制細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性增加Bcl-2表達(dá)水平[8]。劉新巖等人利用LBP干預(yù)IOS誘導(dǎo)的CHF大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP可抑制CHF大鼠心肌纖維化進(jìn)展[9]。由此可見(jiàn)，枸杞多糖對(duì)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的預(yù)防作用。本研以CHF大鼠為研究對(duì)象，并予以LBP干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBP可顯著改善CHF大鼠心臟收縮及舒張功能，減輕心肌細(xì)胞損傷，同時(shí)抑改善心室結(jié)構(gòu)改變及心肌纖維化進(jìn)展，推測(cè)LBP可以抑制大鼠心室重構(gòu)進(jìn)展并發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

圖5 各組大鼠心臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量沉積、膠原纖維異常增生以及各型膠原比例失調(diào)是加速心室重構(gòu)進(jìn)展的重要病理機(jī)制之一[10-11]。膠原纖維維持心肌結(jié)構(gòu)及功能的主要骨架，其主要包括Ⅰ型和Ⅲ型兩種結(jié)構(gòu)[12]。當(dāng)纖維蛋白合成與降解平衡被打破后，膠原纖維化蛋白逐漸累積，室壁硬度增加、心室順應(yīng)性改變，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能受損[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，心梗發(fā)生后，以Ⅰ型和Ⅲ型為主的膠原蛋白過(guò)量沉積，加速VR的進(jìn)展，是導(dǎo)致心肌梗死后心功能改變的主要病理因素。CHEN等研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白過(guò)量表達(dá)與心功能改變呈負(fù)相關(guān)[14]。因此，有效清除過(guò)量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白沉積，是逆轉(zhuǎn)VR的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)CHF大鼠心肌組織中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)明顯增高，這與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白異常沉積是導(dǎo)致心室硬度增加、引起心肌纖維化的主要原因，而LBP可顯著下調(diào)CHF大鼠心肌組織中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)，這與上述研究結(jié)果一致，均提示LBP對(duì)心衰大鼠心功能的改善作用可能與其抑制心肌組織中Ⅰ型和 Ⅲ 型膠原蛋白異常過(guò)量沉積有關(guān)。

TGF-β1作為重要的促纖維化細(xì)胞因子,主要參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移、凋亡以及以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)的合成,同時(shí)具有誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞分化為有更強(qiáng)組織連接功能的肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化進(jìn)展。Smads蛋白是TGF-β1的下游信號(hào)分子,是唯一可以與TGF-β1結(jié)合的底物[15]，既往研究證實(shí)TGF-β1/Smads通路的激活在促進(jìn)VR進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CHF大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá)及Smad3磷酸化水平均顯著升高，既往研究表明，TGF-β1通路的激活，可促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原蛋白的合成，同時(shí)增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)、加重細(xì)胞凋亡，共同引起心肌功能障礙[17]。這與本研究CHF大鼠心肌組織中collagen I和collagen Ⅲ蛋白高表達(dá)結(jié)果一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)LBP可顯著下調(diào)TGF-β1表達(dá)，并抑制Smad3磷酸化，以上結(jié)果表明，LBP能夠改善CHF大鼠心功能，抑制心肌細(xì)胞損傷,其具體機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1/Smads通路活性進(jìn)而減少心肌組織纖維蛋白沉積、最終抑制心肌纖維化有關(guān)。