趙詠梅，張傳英，席海林

(四川省遂寧市中心醫(yī)院 產(chǎn)前診斷實驗室，四川 遂寧629000)

數(shù)據(jù)報道，我國出生缺陷發(fā)生率約為4%-6%，是出生缺陷大國[1]。其中染色體異常所造成的出生缺陷是我國常見的嚴(yán)重出生缺陷之一，及時參加產(chǎn)前診斷是阻斷出生缺陷發(fā)生的關(guān)鍵[2]。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查簡便、可行、無創(chuàng)，即對發(fā)病率高、病情嚴(yán)重的遺傳性疾病或先天畸形進(jìn)行篩查，對檢出子代具有出生缺陷的高風(fēng)險人群再進(jìn)行進(jìn)一步確診是我國目前預(yù)防出生缺陷的重要手段[3-4]。早期有研究報道，孕5周后胎兒DNA便能釋放至母體內(nèi)，并在出生后2 h內(nèi)清除，這也是臨床利用胎兒游離DNA(cffDNA)進(jìn)行產(chǎn)前篩查的基礎(chǔ)[5]。如李燕芳等[6]應(yīng)用cffDNA檢測21、18、13三體綜合征也取得滿意獲益。本研究對孕中期高危孕婦進(jìn)行cffDNA檢測，并分析其與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性，以期為孕中期高危孕婦的產(chǎn)前篩查和診斷提供參考依據(jù)，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年7月-2019年7月在遂寧市中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心接受外周血cffDNA篩查的3176例孕中期高危孕婦，年齡21-45歲；篩查者均符合《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范(2016)》[7]中孕婦外周血cffDNA檢測適用范圍。包括血清學(xué)篩查為臨界風(fēng)險者(篩查風(fēng)險值在1/1000≤T21風(fēng)險值<1/270)；高齡(年齡≥35歲)；合并介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥者；孕20+6周以上錯過血清學(xué)篩查時間，但要求評估21、18、13三體綜合征風(fēng)險者；夫婦一方有明確染色體異常；胎兒超聲檢查顯示軟指標(biāo)或結(jié)構(gòu)異常者等。具有上述檢測指征的孕婦在充分知情同意情況下選擇外周血cffDNA產(chǎn)前篩查。

1.2 方法

cffDNA檢測：采集孕婦10 ml外周血，置于cell free DNA BCT采血管，顛倒混勻后低溫(4℃-8℃)保存待檢。將采集管4℃、1 600 g條件下離心10 min，吸取上清液，16 000 g離心10 min，留取上層血漿；應(yīng)用磁珠法對分離好的血漿樣品進(jìn)行游離DNA提??；Qubit定量分析儀檢測血漿cffDNA濃度。應(yīng)用可逆末端終止測序法構(gòu)建測序文庫，針對cffDNA將下片段DNA末端補(bǔ)平，再與測序通用引物進(jìn)行接頭對接；應(yīng)用貝瑞和康高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒對文庫構(gòu)建產(chǎn)物進(jìn)行純化，Stepone QPCR儀對純化后的DNA文庫進(jìn)行定量檢測。NextSeq CN500基因測序儀、參照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對構(gòu)建成功的文庫進(jìn)行檢測，將上機(jī)測物所得數(shù)據(jù)上傳至貝比安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)與人類基因組序列進(jìn)行對比分析，參照Denis Lo計算方法獲得Z值。Z值代表計算每條染色體所占比例的評分結(jié)果，Z值>3.0樣本判定為該染色體三體，<-3.0則提示該染色體單體高危，-3

染色體核型分析：對cffDNA檢查高風(fēng)險的孕婦，經(jīng)孕婦知情同意后開展超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺，采集20ml羊水常規(guī)離心去上清液，保留0.5 ml，與4.5 ml羊水培養(yǎng)基混合后接種于25ml無菌培養(yǎng)管后獨立培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%CO2、37℃)，8-10 d后常規(guī)制片、烤片、G顯帶并參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN，2016)對核型分析結(jié)果進(jìn)行描述。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用n(%)描述，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕中期高危孕婦產(chǎn)前診斷指征分布3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前診斷指征分別：高齡(年齡≥35歲)33.63%(1068/3176)、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險994/3176(31.30%)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險18.29%(581/3176)、不良孕產(chǎn)史2.90%(92/3176)、B超軟指標(biāo)異常2.39%(76/3176)、B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常0.22%(7/3176)、其他11.30%(359/3176)，見圖1。

圖1 高危產(chǎn)前診斷指征分布

2.2 孕中期高危孕婦的cffDNA檢測結(jié)果3176例孕中期高危孕婦cffDNA檢查結(jié)果顯示，57(1.79%)例孕婦外周血cffDNA檢查結(jié)果為高風(fēng)險，21三體占40.35%，性染色體非整倍體(sex chromosome abnormalities,SCA)其次，見表1。

表1 孕中期高危孕婦的cffDNA檢測結(jié)果(n，%)

2.3 孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征的相關(guān)性B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦外周血cffDNA檢測高風(fēng)險相對比例最高，為28.57%，其次為血清學(xué)篩查高風(fēng)險(2.75%)、不良孕產(chǎn)史(2.17%)、高齡(1.97%)、 血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(1.21%)、其他(1.12%)，見表2。

表2 孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征的相關(guān)性(n，%)

2.4 cff-DNA產(chǎn)前篩查高風(fēng)險對胎兒染色體異常的準(zhǔn)確性分析57例孕婦外周血cffDNA高風(fēng)險患者中，染色體核型分析染色體核型異常32例，cffDNA高風(fēng)險預(yù)測21三體的準(zhǔn)確率最高，為82.60%，其次為18三體、SCA，見表3。

表3 cff-DNA產(chǎn)前篩查高風(fēng)險對胎兒染色體異常的準(zhǔn)確性分析

3 討論

據(jù)相關(guān)資料顯示，我國新生兒出生缺陷概率為5.6%，降低出生缺陷倍受社會多方關(guān)注。早中期產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷更具有臨床意義。尤其是孕中期高風(fēng)險孕婦，要面對創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的壓力，部分孕婦甚至因此拒絕接受產(chǎn)前診斷，這也是羊水穿刺產(chǎn)前診斷接受率低的主要原因之一，從而導(dǎo)致病例漏診[8-9]。而母體血漿cffDNA無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查染色體非整倍體作為相對理想、且對胎兒無風(fēng)險的產(chǎn)前檢查途徑，無疑為孕中期高危孕婦的產(chǎn)前檢查提供了新途徑，對降低出生缺陷、提高優(yōu)生優(yōu)育率有重要價值[10]。但孕婦外周血cffDNA含量受孕婦體重、孕周等因素影響，存在cffDNA檢查誤診或漏診現(xiàn)象。如張玢等[11]報道孕婦外周血cffDNA無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)檢測失敗率為0.088%，這說明cffDNA檢查也存在局限性，需與其他相關(guān)產(chǎn)前檢查手段聯(lián)合診斷。

當(dāng)前研究所報道的外周血cffDNA主要側(cè)重于與產(chǎn)前介入診斷結(jié)果的比較，而分析孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性的報道較少，因此，本研究回顧性分析3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前篩查資料，著重探究孕中期高危孕婦外周血中cffDNA與高危產(chǎn)前診斷指征相關(guān)性。本研究顯示，3176例孕中期高危孕婦的產(chǎn)前診斷指征主要為高齡(年齡≥35歲)33.63%、血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險31.30%、血清學(xué)篩查高風(fēng)險18.29%。其中高齡(年齡≥35歲)比例較高的原因可能與近年國家全面二胎政策的開放有關(guān)。血清學(xué)篩查人群僅次于高齡，這與國內(nèi)開展孕婦外周血cffDNA檢測的首要指征是血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險有關(guān)[12-13]。cffDNA檢查結(jié)果顯示1.79%的孕婦外周血cffDNA檢查結(jié)果為高風(fēng)險，其中以B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦外周血cffDNA檢測高風(fēng)險相對比例最高，為28.57%。由此可見，對B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、外周血cffDNA檢測高風(fēng)險孕婦或應(yīng)盡可能接受介入性產(chǎn)前診斷，并可依據(jù)具體情況考慮是否進(jìn)一步接受其他相關(guān)產(chǎn)前診斷技術(shù)檢查[14]。B超提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕中期高危孕婦外周血中cffDNA篩查高風(fēng)險比例需引起重視。謝佐蓮等[15]也報道相似，孕婦外周血cffDNA檢測技術(shù)可作為產(chǎn)前篩查的有效輔助手段，但基于cffDNA檢查技術(shù)對性染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值較低這一局限性，當(dāng)cffDNA檢測為高風(fēng)險時，一定要與相關(guān)產(chǎn)前診斷技術(shù)來驗證[16]。本研究進(jìn)一步與染色體核型分析結(jié)果比較，結(jié)果顯示57例孕婦外周血cffDNA高風(fēng)險患者中，染色體核型分析染色體核型異常臨床為56.14%，cffDNA高風(fēng)險預(yù)測21三體的準(zhǔn)確率最高，為82.60%，其次為18三體、SCA。由此也可見，具高危產(chǎn)前診斷指征的孕婦開展cffDNA監(jiān)測十分必要，對cffDNA高風(fēng)險群體進(jìn)一步開展染色體核型分析于優(yōu)生優(yōu)育有益。