周堤俠，呂海棟

(青海省人民醫(yī)院 腫瘤外科，青海 西寧 810007)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界范圍內常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌、胃癌，居于惡性腫瘤第3位；其病死率在癌引起的死亡病例中居于第4位[1]。在CRC的臨床治療中，常用的有手術治療、化學治療、放射治療、靶向藥物治療4種治療策略，而目前手術治療作為CRC的主要治療方法。但是由于缺乏有效的早期診斷方法，80%的CRC患者就診時已屬中晚期，造成術后的復發(fā)風險升高或者失去手術的機會，進而超成患者的不良預后[2]。在CRC的進展中，多種基因、RNA和蛋白的表達異常，這些分子有望成為CRC的早期診斷標志物以及復發(fā)轉移的治療靶點。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一組長度超過200 bp不具備完整蛋白編碼功能、缺少特異開放閱讀框的RNA，已經有大量的研究表明lncRNAs可以影響多種腫瘤的進展[3]。LncRNA antisense 1 to micro-chromosome maintenance protein 3-associated protein(MCM3AP-AS1)基因位于21號染色體上，近年來有研究報道，MCM3AP-AS1在成膠質瘤細胞瘤和肝癌的進展中發(fā)揮了重要作用[4-5]。與lncRNA同屬于非編碼RNA的microRNAs(miRNAs)，它是一種具有高度保守序列的非編碼微小RNA分子。miRNAs參與調控一系列生理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、信號傳導和器官發(fā)育等[6]。據(jù)研究，miR-876是由人類染色體9p21.1轉錄的前體RNA剪切而來，它在乳腺癌[7]、胃癌[8]的進展中發(fā)揮了重要作用。然而，目前關于MCM3AP-AS1和miR-876-5p的表達與CRC關系的研究較少，因此，本研究擬檢測MCM3AP-AS1在CRC組織和細胞中的表達水平，并利用CRC細胞系HCT-116細胞為研究對象，探討其對HCT-116細胞增殖、遷移的作用及對miR-876-5p的調控機制，以期為臨床上診斷和治療CRC提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織收集:選取2017年5月至2018年5月青海省人民醫(yī)院收治的30例CRC患者的癌組織及相應癌旁組織標本(收集的癌旁組織標本距離手術切緣至少3 cm)，且癌旁組織標本術后經病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞。所有標本取下后立即儲存在-196 ℃液氮中直到用于提取RNA和其他實驗。所有研究對象術前均未接受化療、放療等輔助治療。本研究獲得青海省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(文號：2017-50)，所有參與患者的知情同意。

1.1.2 試劑:人正常結腸細胞系NCM460和結直腸癌細胞系(colorectal cancer cell lines)SW620、HT-29、HCT-8和HCT-116 (中國科學院上海生命科學院細胞資源中心)；DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司)；LipofectamineTM3000、Trizol試劑(Invitrogen 公司)；miR-876-5p模擬物 (miR-876-5p mimics)、miR-876-5p抑制劑(miR-876-5p inhibitors)、MCM3AP-AS1過表達質粒、靶向MCM3AP-AS1的shRNA以及相應的陰性對照物(中國廣州RiboBio公司)；SYBR預混劑EX TAQ Ⅱ(TaKaRa公司)；ABI 7500實時PCR系統(tǒng)(美國應用生物系統(tǒng)公司)；熒光素酶報告基因系統(tǒng)(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染:在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)上述細胞。取對數(shù)增殖期的HCT-116細胞，以5×106個/cm2在轉染前1 d接種于6孔板，保證轉染時細胞匯合度達到50%以上。轉染操作嚴格按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書將過表達MCM3AP-AS1的質粒、靶向MCM3AP-AS1的shRNA、miR-876-5p模擬物(miR-876-5p mimics)轉染HCT-116細胞。

1.2.2 qRT-qPCR檢測細胞和組織中mRNA的表達：根據(jù)各基因在GenBank中的序列號，用Primer6.0軟件設計引物。使用Trizol提取總RNA，用MMLV反轉錄酶進行反轉錄，產生第一鏈cDNA。在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)上，用SYBR預混劑EX TAQ Ⅱ按照制造商的說明進行PCR。以GAPDH作為MCM3AP-AS1的標準化內參，U6作為miR-876-5p的標準化內參，基因表達的結果采用2-ΔΔCt方法進行計算。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 MTT法測定細胞增殖：取對數(shù)期生長期的HCT-116細胞，在96孔板中加入100 μL細胞(約4×103個/孔)，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，每組設置5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入50 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，用平板搖床搖勻，待結晶溶解后用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度值。

1.2.4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移：按照5×106個/孔細胞數(shù)將HCT-116細胞接種于6孔板中，當HCT-116細胞匯合時，用無菌200 μL管尖垂直劃線，在匯合的單層中間形成一個直接的劃痕。然后，用無血清培養(yǎng)基溫和清洗劃痕損傷細胞單層3次。在完整的培養(yǎng)基中愈合。劃痕形成后0 和24 h，拍攝并計算顯微鏡下的劃痕寬度。通過確定閉合百分比來評估細胞遷移。每個實驗重復3次，測量3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞遷移：取2×104個/孔加入Transwell上室，下室中加600 μL的含20%FBS的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)。12 h后去除上室細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%的結晶紫染色，晾干后拍照并計數(shù)。

1.2.6 熒光素酶實驗：野生型MCM3AP-AS1及突變型MCM3AP-AS1的目的片段被構建并整合入pGL3 vector以構建pGL3-MCM3AP-AS1-wild type (MCM3AP-AS1-wt)和pGL3-MCM3AP-AS1-mutant (MCM3AP-AS1-mut)報告載體。然后將細胞接種于24孔板上，每孔1×105個細胞。并用LipofectamineTM3000將miR-876-5p mimics或陰性對照物分別與MCM3AP-AS1-wt或MCM3AP-AS1-mut報告載體轉染HCT-116細胞。轉染48 h后測定熒光素酶活性。每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MCM3AP-AS1在CRC中表達上調

與對照組相比，CRC組織和細胞系中MCM3AP-AS1表達水平顯著上調(P<0.001)(圖1A,B)。而且MCM3AP-AS1的表達上調與CRC患者的無病生存期(diease free survival, DFS)呈負相關(圖1C)。

A,B.LncRNA MCM3AP-AS1 expression in CRC tissue and cells； C.survival analysis for MCM3AP-AS1 expression and diease free survival of patients with CRC; △P<0.001 compared with normal；*P<0.01, **P<0.001 compared with NCM460

2.2 敲低MCM3AP-AS1抑制CRC的增殖和遷移能力

sh-MCM3AP-AS1成功轉染HCT-116細胞(圖2A)。與sh-NC組相比，敲低MCM3AP-AS1后，HCT-116細胞的增殖能力降低，劃痕愈合能力降低，遷移細胞數(shù)減少(圖2B～D)。

2.3 MCM3AP-AS1靶向miR-876-5p

miR-876-5p是MCM3AP-AS1的候選靶點之一(圖3A)。此外，miR-876-5p mimics可抑制MCM3AP-wt組的熒光素酶報告體的熒光素酶活性，而對MCM3AP-mut組的熒光素酶活性無顯著影響(圖3B)。CRC組織和細胞系中miR-876-5p的表達均顯著下調(圖3C,D)。miR-876-5p與MCM3AP-AS1呈負相關(圖3E)。而且敲低MCM3AP-AS1可促進miR-876-5p的表達(圖3F)。

2.4 miR-876-5p mimics抑制CRC細胞的增殖和遷移

miR-876-5p mimics成功轉染HCT-116細胞系(圖4A)。與miR-control組相比，轉染miR-876-5p mimics后，HCT-116細胞的增殖和遷移能力均受到抑制(圖4B～D)。

2.5 MCM3AP-AS1+ miR-876-5p對CRC細胞的增殖和遷移

過表達MCM3AP-AS1+miR-876-5p mimics成功轉染HCT-116細胞(圖5A，B)。與NC組相比，MCM3AP-AS1可促進細胞的增殖和遷移。而轉染miR-876-5p mimics可削弱MCM3AP-AS1對細胞增殖和遷移的促進作用(圖5C～E)。

A.HCT-116 cells were transfected with sh-MCM3AP-AS1；B-D.tThe effects of sh-MCM3AP-AS1 on HCT-116 cells proliferation and migration; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with sh-NC

A.binding sites of MCM3AP-AS1 and miR-876-5p；B.double luciferase report assay, *P<0.001 compared with miR-control；C,D.miR expression in CRC tissue and cells；#P<0.001 compared with normal；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with NCM460；E.correlation between MCM3AP-AS1 and miR-876-5p expression; F.the effect of MCM3AP-AS1 on miR-876-5p expression; △P<0.001 compared with sh-NC

3 討論

CRC嚴重威脅人類生命安全,尋找早期診斷和治療CRC的生物標志物具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1在CRC組織和細胞中表達上調并與患者不良預后呈顯著相關。

LncRNAs在CRC的進展中發(fā)揮了重要作用。例如，LncRNA GLCC1在CRC中表達上調并與CRC患者不良預后相關，而且GLCC1通過與HSP90分子伴侶直接相互作用而穩(wěn)定了c-Myc轉錄因子的泛素化，從而促進CRC的葡萄糖代謝及其惡性進展[9]。類似研究表明，Lnc PLncRNA-1在CRC中表達上調，進一步研究表明Lnc PLncRNA-1通過吸附miR-204激活Wnt/β-catenin途徑加速了細胞周期進程，并通過抑制CRC細胞凋亡，促進腫瘤的生長和轉移[10]。本研究發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1在CRC中表達上調，敲低MCM3AP-AS1可抑制CRC細胞的增殖和遷移，這表明MCM3AP-AS1可促進CRC的惡行進展。

miRNAs可以在抑癌基因惡行腫瘤中發(fā)揮作用。例如，miR-193a-3p能夠通過下調PLAU抑制CRC的發(fā)生和發(fā)展[11]。據(jù)報道，miR-876-5p在乳腺癌[7]、胃癌[8]、中表達顯著下調，并抑制腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p在CRC組織和細胞中表達顯著下調，進一步實驗表明miR-876-5p可抑制CRC細胞的增殖和遷移。這表明miR-876-5p在CRC中作為抑癌基因發(fā)揮作用。

競爭性內源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)分子機制假說表明，lncRNA通過吸附 miRNA靶向調控mRNA在腫瘤中發(fā)揮作用[12]。例如，MCM3AP-AS1通過調節(jié)miR-211-5p/SPARC軸促進乳頭狀甲狀腺癌的進展[13]。在肝癌中，LINC-ROR通過吸附miR-876-5p上調FOXMI的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移[14]。而在CRC中，LncRNA GAS5通過靶向miR-222-3p抑制癌細胞的增殖，促進細胞的凋亡[15]。而本研究中相關機制實驗驗證了CRC中MCM3AP-AS1可靶向調控miR-876-5p并負向調節(jié)miR-876-5p的表達，功能上miR-876-5p可削弱MCM3AP-AS1對CRC細胞增殖和遷移的促進作用。綜上，MCM3AP-AS1可通過吸附miR-876-5p促進CRC的進展。

A.HCT-116 cells were transfected with miR-876-5p mimics；B-D.the effects of miR-876-5p mimics on HCT-116 cells proliferation and migration; *P<0.01, **P<0.001 compared with miR-control

總之，本研究證明了MCM3AP-AS1在CRC組織和細胞中表達上調，并與患者不良預后相關；進一步研究表明MCM3AP-AS1通過吸附miR-876-5p促進CRC細胞增殖和遷移。這些發(fā)現(xiàn)可能為CRC的診斷和臨床治療提供新的生物標志物和治療靶點。

A，B.HCT-116 cells were transfected with MCM3AP-AS1+miR-876-5p mimics；C-E.the effects of MCM3AP-AS1+miR-876-5p mimics on HCT-116 cells proliferation and migration; *P<0.01, **P<0.001 compared with NC；#P<0.05 compared with NC+ MCM3AP-AS1