李曉勇, 宋來春, 陶 超, 金 晶, 許 銘

(武漢科技大學附屬武漢亞洲心臟病醫(yī)院 心外科 職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430022)

先天性心臟病 (congenital heart disease, CHD) 占兒童出生缺陷率的首位，發(fā)病率高，危害大，其病因仍然不明[1]。近期研究表明，基因異常在其發(fā)病機制中起重要作用。唐氏綜合征是最常見的導致CHD的遺傳性疾病，其21號染色體上的鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1基因(regulator of calcineurin 1, RCAN1)被證明是先天性心臟缺陷相關(guān)的致病基因[2-3]。RCAN1主要有2個亞型，RCAN1-1主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，RCAN1-4主要在心肌、胎兒腎臟中表達，這種組織特異性表達的機制不清[4]。因此本課題擬從轉(zhuǎn)錄調(diào)控入手，研究RCAN1基因不同亞型的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的差異，探索其在人體內(nèi)特異性表達的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RCAN1基因及其上游的序列參照RefSeq (NG-007071.1) 以及UCSC、LOVD、千人基因組計劃等數(shù)據(jù)庫。定點突變試劑盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, TOYOBO公司)。熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega公司)。熒光定量PCR試劑盒 (GoTaq qPCR Master Mix, Promega公司)。光輝霉素(18378-89-7，Amresco公司)。RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆及定點突變： RCAN1-1和RCAN1-4分別通過兩個不同的啟動子來轉(zhuǎn)錄，兩個啟動子區(qū)分別位于第1和第4外顯子的上游。在TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中通過在線生物信息學軟件AliBaba 2.1預測兩個啟動子區(qū)所有可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(http://www.gene-regulation.com)，結(jié)合既往文獻報道及物種屬性(只在人體內(nèi)表達)，再對比分析兩個啟動子區(qū)的差別，初步篩選出一個具有差異性的候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點：Sp1，位于第1外顯子上游-129至-138堿基位置，符合Sp1經(jīng)典結(jié)構(gòu)nyCCGCCsmC。

本課題組前期已克隆出RCAN1的兩個啟動子[5]。通過限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ將RCAN1-1啟動子區(qū)-498-+153克隆至pGL3-basic載體中熒光素酶報告基因的上游，構(gòu)建質(zhì)粒pRCAN1-Luc-1，通過RCAN1-1啟動子啟動熒光素酶基因的表達。同樣的方法將RCAN1-4啟動子區(qū)-1 059至-28構(gòu)建質(zhì)粒pRCAN1-Luc-4。設計突變引物(表1)，pRCAN1-Luc-1作為模板,分別定點突變篩選出Sp1結(jié)合位點的關(guān)鍵堿基，構(gòu)建一系列突變質(zhì)粒。PCR條件同說明書。通過測序驗證突變體。將pRCAN1-Luc-1和7個突變體分別轉(zhuǎn)染到HEK293T 細胞中，孵育24 h后裂解，檢測熒光素酶活性來間接測定啟動子活性。

表1 突變引物

1.2.2 熒光定量PCR檢測RCNA1 mRNA： 進一步研究轉(zhuǎn)錄因子Sp1是否特異性調(diào)控RCNA1-1亞型的轉(zhuǎn)錄。本課題組前期已經(jīng)構(gòu)建了包含啟動子區(qū)的RCAN1-1和RCAN1-4表達載體：pCMV-RCAN1-1和pCMV-RCAN1-4質(zhì)粒[6]，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到心肌細胞細胞系H9c2內(nèi)，實驗組加Sp1抑制劑(mithramycin A，光輝霉素)，對照組加溶劑PBS，培養(yǎng)24～48 h后，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為DNA。通過熒光定量PCR定量檢測兩個亞型的mRNA的量。簡要步驟如下：引物參照前期結(jié)果[6]。反應體系(20 μL)包含：GoTag qPCR Master Mix(×2)10 μL，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA 3 μL，雙蒸水6.2 μL。擴增條件：Stage1：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)。Stage2：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。Stage3：溶解曲線。每個樣品都做3個平行孔。通過標準曲線的繪制得到的RCAN1和β-actin的擴增效率分別為94.2%與96%, 最后實驗結(jié)果用2-ΔΔCt法進行相對定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點活性

分別突變單個堿基都可導致啟動子區(qū)活性明顯降低(P<0.001)，初步證明篩選出的Sp1結(jié)合位點是有功能的且每個堿基都是不可或缺的(圖1)。構(gòu)建一個Sp1突變體，將此突變體和對照(pRCAN1-Luc-1)分別轉(zhuǎn)染不同的細胞系，結(jié)果顯示啟動子活性均有顯著下降(均P<0.001)，進一步證明該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是有活性和功能的(圖2)。

*P<0.001 compared with control group圖1 單個堿基突變均使啟動子活性下降Fig 1 Single base mutation decreased the promoter

*P<0.001 compared with control group圖2 在不同的細胞系中都可見Sp1突變使啟動子活性下降Fig 2 Mutation of Sp1 decreased promoter activity in different cell

2.2 Sp1對RCAN1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

實驗組RCAN1-1 mRNA 表達量低于對照組(P<0.001)，而兩組RCAN1-4 mRNA 的表達量無差異(圖3)。

*P<0.001 compared with control group圖3 實驗組RCAN1-1的表達量明顯降低，而RCAN1-4無差別Fig 3 RCAN1-1 decreased in experimental group; RCAN1-4 showed no

3 討論

先天性心臟病(CHD)發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中占0.93%，占出生畸形的40.95%，其不僅發(fā)病率高，且嚴重危害健康，給家庭和社會造成了巨大的影響[7]。然而，CHD的發(fā)病機制仍然不明，目前研究表明基因異常是其重要的致病因素[1, 8]。

唐氏綜合征是最常見的染色體病之一，其突出的臨床表現(xiàn)就是智力缺陷和先天性心臟畸形[9]。唐氏綜合征在21號染色體上的關(guān)鍵致病區(qū)域(down syndrome critical region, DSCR)已經(jīng)被確定，而DSCR1(2007年被更名為RCAN1)是該區(qū)域上最最重要的致病基因之一[9]。RCAN1是最可能的導致唐氏綜合征患者出現(xiàn)先天性心臟畸形的候選基因[9]。胚胎學實驗表明RCAN1在心管形成時就有表達，心臟發(fā)育過程中在動脈干、心球及原始室間隔等組織中集中高表達[10]，而這些部位的分化及形成異常構(gòu)成了絕大多數(shù)先天性心臟病發(fā)病的胚胎學基礎。NF-ATc (nuclear factor of activated T cells) 在心臟間隔及瓣膜的發(fā)育形成中的作用是必不可少的[11]。RCAN1直接抑制鈣調(diào)蛋白磷酸酶，而后者通過對NF-ATc脫磷酸化而促進其表達。因此RCAN1過度表達對NF-ATc起間接抑制作用，可能是導致心臟間隔發(fā)育異常的原因。

RCAN1在人體內(nèi)有很強的組織表達特異性[3,12]。根據(jù)生物學能量最低原則，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達調(diào)控的核心，而啟動子又是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要原件。目前已證明RCAN1-1和RCAN1-4分別由不同的啟動子啟動轉(zhuǎn)錄[3-4,9]。兩個啟動子區(qū)域都有很多潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，但是真正起主要作用的位點及與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子仍未完全闡明。本研究通過系統(tǒng)分析兩個啟動子區(qū)域，鑒定出一個之前未報到過的有活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及相應的轉(zhuǎn)錄因子，初步證明其可能與RCAN1的組織特異性表達相關(guān)。本研究的主要局限是以體外實驗為主，所用心肌細胞只是提供質(zhì)粒表達的環(huán)境。進一步的動物或人體實驗，檢測Sp1在不同組織中的表達差異，能夠更充分地證明Sp1對RCAN1表達的特異性調(diào)節(jié)作用?？傊?，本研究新發(fā)現(xiàn)的Sp1位點有可能作為將來CHD基因篩查或治療的潛在靶點，為探索RCAN1在CHD發(fā)病機制中的作用提供理論基礎。