高嘉寧,張 丹,何海燕,黃田鈁
(1中國科學(xué)院、水利部成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所,四川 成都 610041;2中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3中國科學(xué)院成都生物所,四川 成都 610041)
玫瑰花是薔薇科多年生灌木植物玫瑰(RosarugosaThunb)的干燥花蕾或干花制品,是我國常用的一種花類中藥材,具有疏肝醒脾、活血化瘀、抑菌抗癌、降脂降壓的功效,是痛經(jīng)靈顆粒、舒肝理氣丸、十靈油、乳癖散結(jié)膠囊等30多種中成藥的主要原料[1-2]。作為藥食同源的中藥材,玫瑰花除應(yīng)用于臨床藥用和部分保健品外,生活中也常用新鮮玫瑰花或干花泡茶飲用,具有清熱解毒、潤腸通便、清爽提神、調(diào)經(jīng)活血、促進(jìn)代謝、增強(qiáng)免疫力和延年益壽等獨(dú)特功效[3]。
玫瑰花化學(xué)成分復(fù)雜,含有維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、揮發(fā)油、色素、多酚、黃酮和微量元素等多種成分[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),每100 g玫瑰花蕾中含有2 000 mg維生素C,其含量僅次于刺梨和金櫻子,是中華獼猴桃的8倍,蘋果的700多倍[6]。李鐵純等對比分析了干、鮮玫瑰花的揮發(fā)油物質(zhì)含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種玫瑰花精油中的芳香成分存在明顯差異,干花中醛類相對含量較高,而鮮花中酯類物質(zhì)的相對含量較高[7]。近年來,對玫瑰花化學(xué)成分的研究主要集中在色素、黃酮、多糖和芳香成分的分離鑒定與藥理活性方面,而對酚酸類物質(zhì)含量及其抗氧化能力的研究相對很少報道[8-9]。植物多酚是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、化學(xué)性質(zhì)活潑的化合物,在藥理上具有顯著的抑菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤效果[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),多酚不僅是一種強(qiáng)抗氧化劑,還可以協(xié)同胡蘿卜素和維生素C、E等其他抗氧化物質(zhì)清除許多與人體病理和生理疾病密切相關(guān)的自由基,如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基和羥自由基(·OH)[12-13]。Nowak等研究發(fā)現(xiàn)玫瑰花蕾、葉中均含有豐富的酚酸類物質(zhì),對治療和預(yù)防癌癥、心血管疾病和老年癡呆癥等現(xiàn)代慢性生理疾病具有良好的功效[14]。因此,本文對比分析了不同產(chǎn)地的7種玫瑰花多酚類物質(zhì)含量,并對其抗氧化活性進(jìn)行評估,為玫瑰花深度開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 儀器
Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);UV-2754型紫外分光光度計(上海元析儀器公司);Eyela型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化公司);HQ-60渦旋混合器(東京理化公司);Eyela Fd-1冷凍干燥機(jī)(東京理化公司)。
1.1.2 試劑
沒食子酸、槲皮素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品均購買自上海麥克林生化科技有限公司,CAS號分別為149-91-7、117-39-5和4852-22-6。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司,CAS號為154-23-4。鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜實驗科技股份有限公司,CAS號為1401-55-4。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼購自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司。其他試劑均購自中國食品藥品檢定研究院:甲醇、乙腈、甲酸、三氟乙酸為色譜純,鹽酸、無水乙醇、丙酮、正丁醇、十二水合硫酸鐵胺、硫酸鐵、鄰二氮菲、過氧化氫溶液為分析純,水為純水。
1.2.1 樣品制備
2019年11月,在各玫瑰花種植基地內(nèi)采用隨機(jī)標(biāo)記法采樣,共收集樣品30份,經(jīng)鑒定均為薔薇科薔薇屬玫瑰(Rose.rugosa),樣品的詳細(xì)信息見表1。將采集的玫瑰花按自然晾曬風(fēng)干或烘干(50 ℃)方式處理至恒重,粉碎過40目篩,實驗備用。
表1 不同產(chǎn)地、品種玫瑰花樣品信息
1.2.2 檢測方法
兒茶素和沒食子酸含量測定采用HPLC法,具體測定方法參照文獻(xiàn)[15]:
1)色譜條件:Phenomenex luna C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);檢測波長280 nm,流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈,梯度洗脫(0~42 min,A:30.0%~96.0%;43~45 min,A:96.0%~30.0%)。
2)對照品溶液制備:分別精密稱定對照品0.1000 g,用甲醇配制成混合液。
3)線性關(guān)系考察:以標(biāo)準(zhǔn)品各組分濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),以此來考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性。結(jié)果顯示,線性范圍為0.1~200 μg/mL,相關(guān)系數(shù)0.998,精密度RSD為0.58%,重復(fù)性RSD為0.99%,定量限為0.05 μg/mL;沒食子酸線性范圍為0.1~200 μg/mL,相關(guān)系數(shù)0.998,精密度RSD為0.69%,重復(fù)性RSD為1.37%,定量限為0.05 μg/mL。
4)樣品測定:稱取0.2000 g玫瑰花粉末,依照1)色譜條件測定兒茶素和沒食子酸含量。每個樣品重復(fù)測定3次。
槲皮素含量測定采用HPLC法,具體測定方法參照文獻(xiàn)[16]:
1)色譜條件:Phenomenex luna C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);檢測波長280 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動相A為1%甲酸水溶液,B為乙腈,梯度洗脫(0~42 min,A:4.0 %~60.0 %;42~43 min,A:60.0%~4.0%)。
2)對照品溶液制備:分別精密稱定對照品0.50 g,用液氮研磨至粉末狀,加入5 mL提取液(甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1),制成混合溶液。
3)線性關(guān)系考察:根據(jù)實驗色譜條件,記錄峰面積,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。結(jié)果顯示,線性范圍為0.1~200 μg/mL,相關(guān)系數(shù)0.999,精密度RSD為0.75%,重復(fù)性RSD為1.82%,定量限為0.06 μg/mL。
4)樣品測定:稱取適量玫瑰花粉末,依照1)色譜條件測定槲皮素含量。每個樣品重復(fù)測定3次。
總原花青素含量測定采用紫外分光光度法,具體測定方法參照文獻(xiàn)[17]:測定波長550 nm。線性范圍為0~500 μg/mL,相關(guān)系數(shù)0.996,精密度RSD為2.17%,定量限為10.14 mg/mL。每個樣品重復(fù)測定3次。
總鞣酸含量測定采用紫外分光光度法,具體測定方法參照文獻(xiàn)[18]:測定波長276 nm。線性范圍為0~200 μg/mL,相關(guān)系數(shù)0.999,精密度RSD為1.63%,定量限為0.025 mg/mL。每個樣品重復(fù)測定3次。
DPPH·自由基清除率和·OH自由基清除率測定采用紫外分光光度法[19-21]:
1)DPPH·自由基清除率測定:精密吸取0.35 mg/mL的DPPH·儲備液和1 mL的玫瑰花樣品溶液,置于具塞瓶中避光反應(yīng)0.5 h,于波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)m;吸取0.5 mL的DPPH·儲備液和1 mL蒸餾水,反應(yīng)后測定吸光度值A(chǔ)0;吸取0.5 mL無水乙醇和1 mL樣品溶液,反應(yīng)后測定吸光度值A(chǔ)n。根據(jù)公式(1)計算DPPH·自由基清除率。
2)·OH自由基清除率測定:吸取玫瑰花樣品溶液1 mL置于量瓶中,分別加入2 mL pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液和1 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液,再加入1 mL 0.1%過氧化氫溶液和1 mL 7.5 mmol/L的硫酸鐵溶液,定容至10 mL,37 ℃水浴1 h,在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)1;用水代替樣品溶液,重復(fù)上述操作,測定A2;用水代替樣品溶液和過氧化氫溶液,重復(fù)上述操作,測定A0。根據(jù)公式(2)計算·OH自由基清除率。
(1)
(2)
數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)、Pearson相關(guān)分析和聚類分析(cluster analysis:CA),采用Excel 2016 軟件進(jìn)行圖表繪制。
2.1.1 不同產(chǎn)地的玫瑰花多酚含量
不同產(chǎn)地玫瑰花兒茶素、沒食子酸、槲皮素、總原花青素和總鞣酸含量見表2。由表2可知,不同產(chǎn)地玫瑰花兒茶素平均含量為4.34 mg/g,中位數(shù)為1.78 mg/g,變異系數(shù)Cv為106.9%;沒食子酸平均含量為0.78 mg/g,中位數(shù)為0.57 mg/g,變異系數(shù)Cv為104.3%;槲皮素平均含量為62.95 mg/kg,中位數(shù)為58.65 mg/kg,變異系數(shù)Cv為56.4%;總原花青素平均含量為6.98 mg/g,中位數(shù)為7.21 mg/g,變異系數(shù)Cv為44.1%;總鞣酸平均含量為63.17 mg/kg,中位數(shù)為61.48 mg/kg,變異系數(shù)Cv為33.6%。由此可見,5種酚酸類物質(zhì)的平均含量由高到低依次為總原花青素>兒茶素>沒食子酸>總鞣酸≥槲皮素,含量變異系數(shù)由高到低依次為兒茶素>沒食子酸>槲皮素>總原花青素>總鞣酸。
表2 不同產(chǎn)地玫瑰花多酚含量
統(tǒng)計分析的結(jié)果表明,山東平陰、吉林長白山和新疆和田玫瑰花兒茶素平均含量為9.41 mg/g,極顯著高于其他產(chǎn)地(FCa=91.61,p<0.001);山東平陰、云南昆明和新疆和田玫瑰花沒食子酸平均含量為1.81 mg/g,極顯著高于其他產(chǎn)地(FGa=49.59,p<0.001);山東平陰、新疆和田和四川瀘定玫瑰花槲皮素平均含量為104.59 mg/kg,極顯著高于其他產(chǎn)地(FQu=29.36,p<0.001);山東平陰、云南昆明、新疆和田、甘肅永登和陜西華縣玫瑰花總原花青素平均含量為9.44 mg/g,極顯著高于其他產(chǎn)地(FTPr=37.39,p<0.001);甘肅永登、陜西華縣和四川瀘定玫瑰花總鞣酸平均含量為80.19 mg/kg,顯著高于其他產(chǎn)地(FTTa=7.32,p<0.05);山東平陰、吉林長白山和新疆和田產(chǎn)的玫瑰花總多酚平均含量為19.39 mg/g,極顯著高于其他產(chǎn)地(FTP=36.73,p<0.001)。綜上所述,山東平陰、新疆和田和吉林長白山玫瑰花多酚含量最高,其次是甘肅永登和陜西華縣,四川瀘定、云南昆明和云南麗江的含量最低,這種差異可能與區(qū)域氣候、土壤等環(huán)境因子有關(guān)。研究認(rèn)為經(jīng)緯度、海拔、日照、年均溫、降雨量、蒸發(fā)量和土壤肥力因子是影響植物多酚含量的主導(dǎo)環(huán)境因子[22-24]。同時,山東平陰和新疆和田是玫瑰花主要的產(chǎn)區(qū),栽培模式、采摘與加工方法等都可能引起品質(zhì)成分含量差異[25]。
2.1.2 不同品種的玫瑰花多酚含量
不同品種玫瑰花5種酚酸類物質(zhì)含量如圖1所示。由圖1可以看出,不同品種的玫瑰花多酚含量存在顯著差異。豐花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰的兒茶素平均含量分別為8.22 mg/g、11.46 mg/g和11.49 mg/g,其含量水平極顯著高于其他品種(FCa=58.04,p<0.001);金邊和紫花重瓣玫瑰的沒食子酸平均含量分別為2.38 mg/g和1.12 mg/g,其含量水平極顯著高于其他品種(FGa=11.01,p<0.01);大馬士革、紫花重瓣、白花重瓣和苦水玫瑰槲皮素平均含量分別為91.95 mg/kg、75.03 mg/kg、53.83 mg/kg和58.49 mg/kg,其含量水平極顯著高于其他品種(FQu=19.56,p<0.001);苦水玫瑰的總原花青素平均含量為1.77 mg/g,其含量水平極顯著低于其他品種(FTPr=9.06,p<0.01);苦水、大馬士革和白花重瓣玫瑰的總鞣酸平均含量依次為89.91 mg/kg、75.27 mg/kg和70.39 mg/kg,其含量水平極顯著高于其他品種(FTTa=34.76,p<0.001);紫花重瓣玫瑰的總多酚平均含量為20.68 mg/g,顯著高于其他品種(FTP=7.12,p<0.05),其次是白花重瓣、豐花、大馬士革和金邊玫瑰,平均含量分別為16.30 mg/g、14.26 mg/g、13.74 mg/g和13.13 mg/g,苦水和墨紅玫瑰平均含量最低,分別為8.17 mg/g和3.33 mg/g。張訸等對比分析了4種玫瑰花中的多酚含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)墨紅玫瑰的平均含量顯著高于大馬士革、滇紅玫瑰和中國紅1號玫瑰,與本文的研究結(jié)果存在一定差異,這可能與樣品的提取和處理工藝有關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn),植物多酚能促進(jìn)人體腸道微生物群中的有益菌的生長,并減少致病菌的數(shù)量[27]。南楠等研究認(rèn)為,植物多酚是一種純天然、無污染的抗生素替代物,在預(yù)防疾病和改善動物性能方面功效突出[28]。鄭紅梅等研究發(fā)現(xiàn),植物多酚能顯著抑制肉制品中的微生物生長,減緩脂肪氧化,有效延長肉制品的保質(zhì)期[29]。本研究發(fā)現(xiàn)紫花重瓣玫瑰、白花重瓣和大馬士革玫瑰的總多酚含量極顯著高于其他品種,認(rèn)為可能具有更廣闊的市場開發(fā)潛力。
圖1 不同品種玫瑰花多酚含量
2.1.3 聚類分析
聚類分析是指對研究對象的諸多特性或指標(biāo)進(jìn)行分類,同一類別因相似度較高則優(yōu)先聚為一類[30]。為了探討玫瑰花酚酸類物質(zhì)含量與產(chǎn)地、品種間的關(guān)系,本文以兒茶素、沒食子酸、槲皮素、總鞣酸和總原花青素含量作為樣品的特征變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)歐氏距離為10.00時,可將不同產(chǎn)地的玫瑰花分為兩類,第Ⅰ類包括S8(甘肅永登,大馬士革玫瑰)、S9(陜西華縣,大馬士革玫瑰)、S6(云南麗江,墨紅玫瑰)、S1(甘肅永登,苦水玫瑰)、S5(云南昆明,金邊玫瑰)和S10(四川瀘定,大馬士革玫瑰);第Ⅱ類包括S3(山東平陰,紫花重瓣玫瑰)、S4(吉林長白山,白花重瓣玫瑰)、S2(山東平陰,豐花玫瑰)和S7(新疆和田,大馬士革玫瑰)。
圖2 不同產(chǎn)地、不同品種玫瑰花聚類分析
從產(chǎn)地的地理位置來看,除S7以外,第Ⅰ類的玫瑰花均產(chǎn)自我國西部地區(qū),而第Ⅱ類產(chǎn)于我國東部沿海地區(qū)。研究表明,降雨量、光照強(qiáng)度、溫度和蒸發(fā)量與植物多酚含量具有顯著相關(guān)性,降雨量與多酚類物質(zhì)含量呈負(fù)效應(yīng),而光強(qiáng)、溫度和蒸發(fā)量越高,越有利于多酚類化合物的代謝與累積[31-33]。新疆屬典型的溫帶大陸性氣候,晝夜溫差大,日照時間長,且降雨量少,從而導(dǎo)致產(chǎn)自新疆和田的大馬士革玫瑰花多酚含量與其他產(chǎn)地的玫瑰花存在顯著差異。從玫瑰花的品種來看,第Ⅰ類包含大馬士革、苦水、金邊和墨紅玫瑰,因此可以認(rèn)為它們具有相似的多酚類物質(zhì)含量水平;而第Ⅱ類包含的豐花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰多酚含量極為相近。
2.2.1 DPPH·自由基清除率
自由基的增多是引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)衰老、癌癥和腫瘤的重要因素之一[34]。本文對不同品種玫瑰花DPPH·自由基清除率進(jìn)行比較分析(圖3(a))。結(jié)果發(fā)現(xiàn),7種玫瑰花均能有效地清除DPPH·自由基,且清除率均為50%以上。其中,苦水、豐花、紫花重瓣、白花重瓣、金邊和墨紅玫瑰的清除率分別高達(dá)92.16%、89.80%、92.37%、91.92%、92.29%和92.28%。周小琦等研究玫瑰干花蕾對DPPH·自由基的清除活性,發(fā)現(xiàn)清除率達(dá)90.23%[35]。童周和甘露等對比分析了多種芳香類植物對DPPH·自由基的清除能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),玫瑰花提取物的清除活性最強(qiáng)[36-37]。
從圖3(a)可以看出,大馬士革玫瑰花的DPPH·自由基清除率均值為71.91%,顯著低于其它品種、品系玫瑰花的清除能力,且清除率隨產(chǎn)地不同存在明顯差異(p<0.05)。不同產(chǎn)地的大馬士革玫瑰花對DPPH·自由基清除率由高到低依次為甘肅永登(86.07%)>新疆和田(81.85%)>陜西的華縣(60.98%)>四川瀘定(58.75%)。統(tǒng)計分析的結(jié)果表明,新疆和田和甘肅永登大馬士革玫瑰花對DPPH·自由基清除率(均值為83.96%)極顯著高于陜西華縣和四川瀘定(均值為59.86,p<0.001)。研究認(rèn)為,DPPH·自由基的清除率主要與多酚、原花青素和黃酮等含量有關(guān),而這些成分在很大程度上受產(chǎn)地地理環(huán)境的影響[38]。
圖3 不同品種玫瑰花自由基的清除能力
2.2.2 ·OH自由基清除率
由圖3(b)可知,不同品種玫瑰花對·OH自由基清除率由高到低依次為墨紅(39.84%)>紫花重瓣(33.92%)>豐花(29.80%)>金邊(27.00%)>苦水(26.73%)>大馬士革(26.59%)>白花重瓣(26.35%)。不同產(chǎn)地的大馬士革玫瑰花對·OH自由基清除率由高到低依次為新疆和田(29.06%)>四川瀘定(26.86%)>陜西華縣(26.15%)>甘肅永登(24.28%)。方差分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同品種或產(chǎn)地的玫瑰花對·OH自由基清除能力均無顯著差異性(p>0.05)。但從圖3(b)可以看出,墨紅玫瑰對·OH自由基清除能力最強(qiáng),這與肖麗宏和張訸等人的研究結(jié)果一致,且在一定范圍內(nèi),隨濃度增加清除率逐漸增強(qiáng)[26,39]。宋寧珂等研究分析4種玫瑰花醇提物清除自由基的結(jié)果顯示,豐花玫瑰清除·OH自由基的能力顯著強(qiáng)于大馬士革玫瑰花[40]。崔莉等對玫瑰花水提取物清除·OH自由基的研究顯示,清除效果依次為紫花重瓣>豐花>墨紅>大馬士革[41]。
表3為不同酚酸類物質(zhì)與2種自由基清除活性的Pearson相關(guān)分析。
表3 抗氧化活性與酚類成分相關(guān)系數(shù)
由表3可知,DPPH·自由基清除率與總鞣酸含量存在極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.001),與槲皮素含量存在顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),·OH自由基清除率與總原花青素含量存在顯著負(fù)相關(guān)性(p<0.05)。說明多酚類化合物對玫瑰花的抗氧化活性起著關(guān)鍵作用,其中,鞣酸、槲皮素和原花青素是其主要抗氧化成分,這與前人的研究結(jié)果一致[36]。同時,6種酚酸類物質(zhì)含量間也存在一定相關(guān)關(guān)系。從表3可以看出,總原花青素與沒食子酸和總多酚含量間存在極顯著正相關(guān)性(p<0.001),兒茶素與總多酚含量存在極顯著正相關(guān)性(p<0.001),沒食子酸與總多酚含量存在顯著正相關(guān)性(p<0.05)。
研究發(fā)現(xiàn),不同品種的玫瑰花5種酚酸類物質(zhì)含量存在顯著差異。其中,紫花重瓣玫瑰的總多酚平均含量最高,為20.68 mg/g;其次是白花重瓣、大馬士革和豐花玫瑰,平均含量分別為16.30 mg/g、13.13 mg/g和12.36 mg/g;其余玫瑰花的總多酚含量相對較低。另外,產(chǎn)自山東平陰、新疆和田和吉林長白山的玫瑰花總多酚平均含量最高,分別為20.68 mg/g、21.20 mg/g和16.30 mg/g;其次是甘肅的永登和陜西的華縣,平均含量分別為10.42 mg/g和9.31 mg/g。基于5種多酚類物質(zhì)含量,聚類分析將玫瑰花明顯分為兩類,第Ⅰ類包含的品種有大馬士革、苦水、金邊和墨紅玫瑰,均產(chǎn)自我國西部地區(qū),認(rèn)為它們具有相似的多酚類物質(zhì)含量水平;第Ⅱ類包含的品種有豐花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰,均產(chǎn)自我國東部沿海地區(qū),其多酚含量較為相近。初步認(rèn)為,這種差異一方面受種質(zhì)遺傳因素的影響,另一方面產(chǎn)地的地理氣候因子,如溫度、光強(qiáng)、日照時間、海拔等也極大的影響了酚酸類代謝產(chǎn)物的積累。
不同品種的玫瑰花對DPPH·自由基和·OH自由基的清除率也存在顯著差異。其中,紫花重瓣玫瑰對DPPH·自由基和·OH自由基清除率最高,分別為92.37%和33.92%;其次是墨紅玫瑰、金邊玫瑰和苦水玫瑰,對DPPH·自由基的清除率分別為92.28%、92.29%和92.16%,對·OH自由基清除率分別為39.84%、27.00%和26.73%;大馬士革玫瑰花對自由基清除率最低,但依產(chǎn)地不同存在較大差異,其中以新疆和田的大馬士革玫瑰花對2種自由基的清除率最高,分別為81.85%和29.06%。綜合考慮,山東平陰的紫花重瓣玫瑰和新疆和田的大馬士革玫瑰多酚含量較高,且對2種自由基的清除活性強(qiáng),認(rèn)為具有更大的市場開發(fā)潛力。