楊婷婷，鐘 可，黃芯琦，劉 珂

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科多年生草本植物，是珍稀名貴中藥石斛的來源之一，具有滋陰養(yǎng)腎，清熱生津的功效[1]。主要分布于我國貴州、四川、廣西、云南和海南等省，在貴州主產(chǎn)于赤水市，有“赤水金釵石斛”之稱，為道地藥材[2-3]。金釵石斛化學成分有生物堿類、多糖、倍半萜、聯(lián)芐、芴酮、酚酸、苯丙素、菲類、木脂素類化合物，多糖是金釵石斛主要活性成分之一[3-4]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗衰老、抗氧化等作用[5-7]，因此建立金釵石斛多糖有效、簡便、可靠的測定方法有重要的實踐意義。水提醇沉回流提取法是多糖常用傳統(tǒng)提取方法[8]，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的測定。本實驗選取貴州赤水金釵石斛為實驗對象，通過正交設計對提取溶劑加入量、提取溫度、提取時間、顯色劑用量、顯色反應時間進行考察，優(yōu)選最佳提取條件及顯色條件，確定金釵石斛多糖最佳測定方法。金釵石斛的傳統(tǒng)藥用部位為莖，目前研究也集中在金釵石斛莖，對金釵石斛花和葉的研究相對較少，市場上有金釵石斛花茶作為保健品使用，金釵石斛花和葉的開發(fā)利用具有極其廣闊的市場前景。通過建立的方法對金釵石斛莖、花、葉中的多糖含量進行測定，可為金釵石斛的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

實驗所用12批金釵石斛藥材均采自貴州省赤水市，北緯28°30′50″，東經(jīng)105°52′43″，海拔510 m。均為仿野生栽培品，隨機取樣，樣品來源見表1。經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學鐘可副教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛DendrobiumnobileLindl.。采收后的莖除去雜質(zhì)，用開水略燙或烘軟，再邊搓邊烘曬至葉鞘搓凈，于烘箱60 ℃烘干；金釵石斛葉經(jīng)洗凈處理后，于烘箱60 ℃烘干；將金釵石斛花鮮品低溫烘干。以上樣品均粉碎過3號篩備用。D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201808，僅供國家藥品標準檢驗用)，石油醚、無水乙醇、苯酚均為分析純，濃硫酸；實驗用水均為娃哈哈純凈水。紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司，UV-5900)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊公司，GZX-9070MBE)；水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司，DRHH-S8)；超聲機(上海喬躍電子有限公司，JOYN-10A)；十萬分之一天平(日本島津公司，ADW120D)、萬分之一天平(梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E)。

表1 樣品來源表

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制

以蒸餾水為空白，分別各精密量取濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖對照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，置10 mL具塞試管中，加水至1.0 mL，精密加入臨用配制的5%苯酚溶液l mL，再精密加4 mL硫酸，搖勻，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管冰浴冷卻5 min。以蒸餾水為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為A=9.33x+0.0355，r2=0.999。

2.2 紫外檢測波長的確定

精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，精密加入0.5 mL蒸餾水，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸4.0 mL搖勻，置90 ℃水浴中加熱15 min后取出并冰浴5 min后，并以蒸餾水為空白對照，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，測得葡萄糖對照品最大吸收峰在488 nm波長處。掃描結果見圖1。

圖1 紫外波長掃描結果

2.3 正交設計優(yōu)選多糖顯色條件與提取工藝

2.3.1 顯色條件

通過L9(34)正交實驗，對苯酚與濃硫酸的加入量和反應時間進行考察，以吸光度為指標確定最佳加入量與反應時間。

分別精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，共9份，精密加入0.5 mL蒸餾水，再加入臨用配置5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸，搖勻，置90 ℃水浴中加熱不同時間后，取出冰浴5 min，于488 nm波長處測定吸光度。因素水平見表2，正交實驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 顯色條件試驗因素

表3 顯色條件正交試驗結果

表4 方差分析結果

直觀分析可知，各因素對吸光度的影響順序為A>C>B，方差分析結果發(fā)現(xiàn)A、B、C均無顯著性影響(P>0.05)。綜合直觀分析及方差分析，選取反應條件為A2B1C1時，即苯酚用量為1.0 mL，濃硫酸用量為4 mL，反應時間為15 min時，吸光度最高。

2.3.2 提取方法

根據(jù)多糖性能選用水提醇沉法進行金釵石斛多糖的提取條件考察，選擇提取溶劑加入量、提取溫度、提取時間3個試驗因素，選用L9(34)正交表對金釵石斛進行石斛多糖的提取與測定，多糖百分含量作為考察指標。

分別稱取金釵石斛莖粉末0.15 g于250 mL圓底燒瓶中，共9份。各加10 mL石油醚回流脫脂1 h，過濾揮干溶媒。藥渣用10 mL 80%乙醇回流除雜 1 h，過濾水浴揮干。藥渣用不同量的蒸餾水按照不同溫度分別提取不同時間，趁熱過濾，定容至250 mL容量瓶中，搖勻，因素水平表見表5。將分別所得金釵石斛供試品溶液，精密吸取0.5 mL于具塞試管中，精密加入0.5 mL蒸餾水，按“2.3.1”所得的最優(yōu)條件反應，測得吸光度，分別代入“2.1”項所得的回歸方程，計算多糖濃度。實驗結果見表6。并以多糖百分含量作為衡量提取效率的客觀指標，優(yōu)選最佳提取工藝。方差分析結果見表7。

表5 提取條件試驗因素表

表6 提取條件正交試驗結果

表7 方差分析結果

由直觀分析可知，各因素對多糖含量的影響順序為A>B>C，方差分析結果表明，A、B、C對提取的多糖濃度無顯著性影響(P>0.05)。結合直觀分析結果，最佳反應條件為A2B2C3時，即提取溫度為100 ℃，加水量為150 mL，提取時間為2 h的條件下，提取的多糖百分含量最高。

2.4 供試品溶液制備及反應條件的確定

稱取樣品粉末0.15 g，置于250 mL圓底瓶中，加10 mL石油醚回流提取1 h，過濾后揮干溶媒；再加入10 mL 80%乙醇回流1 h，過濾水浴揮干，用150 mL的蒸餾水在100 ℃下回流提取2 h，過濾，殘渣用蒸餾水洗滌，定容至250 mL容量瓶中，搖勻即得供試品溶液。最佳顯色反應條件為：取供試品溶液0.5 mL，置10 mL具塞試管中，再加0.5 mL水補至1 mL。取臨用配置5%苯酚溶液l mL，再精密加濃硫酸4 mL，搖勻，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管冰浴冷卻5 min，在488 nm處測定吸光度。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

分別準確量取濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖對照品溶液共6份，按“2.4”項下操作，測定對照品溶液吸光度，RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗

精密稱取同一批金釵石斛樣品6份，每份約0.15 g，按“2.4”項下操作，測定每份樣品吸光度，計算多糖的含量為20.14%，RSD為1.83%，表明方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取金釵石斛樣品粉末0.15g，按“2.4”項下操作，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h測定其吸光度，其RSD為1.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 加樣回收率試驗

精密稱取已知多糖百分比含量為20.14%的金釵石斛莖粉末6份，每份約0.075 g，分別精密加入與樣品中多糖含量相等的D-無水葡萄糖對照品，按“2.4”項下操作，測定樣品吸光度結果見表8，其RSD為1.32%，平均回收率為100.68%，均符合要求。

表8 加樣回收率試驗結果

2.6 樣品中多糖含量測定結果

按“2.4”項下操作，以蒸餾水為空白，對12批樣品進行多糖含量的測定，多糖的百分含量結果見表9。

表9 樣品多糖含量測定結果(n=2)

由測定結果可知，12批樣品中，金釵石斛莖中多糖含量最高，為21.88%，莖、花、葉中多糖含量表現(xiàn)為：莖>葉>花。

3 討論

實驗通過正交設計對金釵石斛多糖提取條件以及顯色條件進行考察優(yōu)選。以多糖百分含量為指標，確定最優(yōu)提取條件為：加入蒸餾水150 mL沸騰后回流提取2 h；以吸光度為指標，最佳顯色條件為：加入苯酚1 mL、濃硫酸4 mL，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管后冰浴冷卻5 min。建立的方法操作簡便，易控制，穩(wěn)定性及精確度高，多糖的得率較高。金釵石斛多糖提取方法多種，如曾雨馨等[8]對金釵石斛多糖超聲提取方法進行了優(yōu)化，荊晶等[9]對微波輔助提取法進行了優(yōu)化，還有酶解輔助提取法等[10]，但多糖經(jīng)過超聲或微波處理后其糖苷鍵可能會發(fā)生斷裂，酶解輔助提取法中酶反應條件要求嚴格，成本較高[7]。水提醇沉回流提取法一直是金釵石斛多糖常用的傳統(tǒng)提取方法，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的測定，水提法[11-13]目前亦有提取工藝的優(yōu)化，但對苯酚-硫酸法顯色條件的考察較少。本實驗在對水提法的提取工藝優(yōu)化的同時，對顯色條件也進行了優(yōu)選，建立的方法可適用于金釵石斛多糖含量的測定。通過實驗建立的方法，對金釵石斛不同部位多糖的含量進行了測定，金釵石斛的傳統(tǒng)藥用部位為莖，實驗結果也表明了莖中多糖含量高于葉與花，但金釵石斛葉與花中亦有較高的多糖含量，可為金釵石斛的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。