趙 杰，徐靜茹，曹 利，朱 雷，劉明達，馮士彬，李 玉，李錦春，吳金節(jié)，王希春

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

蛋白質(zhì)是維持動物機體的物質(zhì)基礎，在動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量處于動態(tài)平衡狀態(tài)，并不是恒定不變的。已有研究表明，飼糧中蛋白質(zhì)含量會直接影響家禽的健康和生產(chǎn)性能，由于家禽缺乏精氨酸酶，不能將代謝過程中生成的氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?，因此蛋白質(zhì)的代謝只能通過嘌呤核苷酸合成與分解途徑進行，最終生成尿酸隨尿液排出體外[1-2]。因此家禽攝入的蛋白質(zhì)過多，會對其機體造成損傷，飼料中添加過多的動物內(nèi)臟、肉骨粉、魚粉等動物性蛋白和大豆、蘑菇等植物性蛋白可以誘發(fā)禽類高尿酸血癥[3-4]。腎是泌尿系統(tǒng)重要的組成器官，負責將血液中的雜質(zhì)及有害物質(zhì)過濾排出體外，腎臟一旦出現(xiàn)問題，會使機體內(nèi)的有毒物質(zhì)滯留在體內(nèi)，存在很大隱患[5-6]。家禽的腎臟疾病可造成養(yǎng)禽業(yè)較大的經(jīng)濟損失，尤其是禽痛風，目前尚無有效的治療方法[7]。腎臟原發(fā)性損傷是痛風的發(fā)病基礎，并且會引起機體氧化損傷和相關基因黃嘌呤氧化酶(XOD)表達紊亂[8-9]。適量自由基可以發(fā)揮正常的生理作用，但是過量自由基會對機體產(chǎn)生毒副作用，影響動物機體的代謝及基因表達[10-11]。

由于禽痛風發(fā)生時腎臟功能變化明顯，從而確立了腎臟在痛風發(fā)生中的主導地位，甚至有些報道將禽痛風又稱為禽腎功能衰竭。但是禽類腎功能異常與機體脂質(zhì)過氧化及XOD基因表達量之間的相關性研究較少。為此，本試驗探討了高蛋白飼糧對白羽肉雞腎臟功能、脂質(zhì)過氧化及XOD基因m-RNA表達量的影響，以期為高蛋白飼糧引起肉雞腎損傷的發(fā)病機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 健康的817白羽肉雜雞120羽(20日齡)，由安徽省宣城市宣城木子禽業(yè)專業(yè)合作社提供。

1.1.2 試劑及儀器 丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羥自由基(·OH)、總抗氧力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和黃嘌呤氧化酶(XOD)ELISA檢測試劑盒，購自南京建成生物技術有限公司；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、鈣(Ca)、磷(P)和鎂(Mg)生化檢測試劑盒，購于南京森貝伽生物科技有限公司；Trizol RNA 提取試劑，購自大連寶生物工程有限公司；StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix，購自北京康潤誠業(yè)生物技術有限公司；BIOMIGA SYBR qPCR Mix試劑盒，購自杭州倍沃醫(yī)學科技有限公司。

FSH-2可調(diào)高速勻漿器，購于金壇市榮華儀器制造有限公司；TGL冷凍高速離心機，購于珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；TBA-120FR全自動生化分析儀，購于日本TOSHIBA公司；Arktik多功能PCR儀，購于美國Thermo有限公司；StepOneTMReal-Time PCR System、Moultiskan MK3酶標儀，購于賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 試驗設計

將120羽20日齡健康白羽肉雜雞隨機均分為對照組(Ⅰ組)和高蛋白飼糧組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，每組5個重復，每個重復6羽。Ⅰ組飼喂基礎飼糧，其蛋白質(zhì)含量約為190 g/kg，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組在基礎飼糧中添加豆粕類添加物，使粗蛋白含量分別約為220，250，280 g/kg，各組飼料組成見表1。對所有的白羽肉雜雞進行腳標編號，嚴格記錄分組情況。試雞按常規(guī)免疫程序進行免疫。試驗雞采用籠養(yǎng)(70 cm×70 cm×40 cm)模式飼養(yǎng)，每籠6羽，按計劃飲食飲水。試驗周期為14 d。

表1 不同蛋白含量飼糧組成和營養(yǎng)水平Table 1 Dietary ingredients and nutrient levels for different proteins contents

1.3 樣品采集

于試驗第0(試驗開始當日)，7，14 天，每組隨機抽取5羽雞，每個重復1羽，經(jīng)翅靜脈采血，血液于37 ℃溫箱中靜置1 h，然后3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝標記，-20 ℃保存。于試驗第14 天，每組隨機抽取5羽試驗雞，每個重復1羽，在無菌條件下采取腎臟組織，于-80 ℃保存待檢。

1.4 血清生化指標檢測

用全自動生化分析儀對白羽肉雜雞血清進行腎功能指標檢測，測定指標主要包括血清鈣(Ca)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血清磷(P)、鎂(Mg)含量等。

1.5 血清氧化與抗氧化指標檢測

血清氧化與抗氧化指標采用ELISA試劑盒進行檢測，測定指標包括血清丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羥自由基(·OH)含量和總抗氧力(T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性等，測定步驟按照試劑盒說明書操作。

1.6 XOD活性檢測

采用ELISA試劑盒對白羽肉雜雞血清XOD的活性進行檢測，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 XOD基因表達的檢測

1.7.1 cDNA的制備及引物設計與合成 將腎臟組織樣本分別用液氮研磨粉碎，加入1 mL Trizol試劑，在碎冰上勻漿，12 000 r/min離心15 min取上清液，加入500 μL酚氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清并加入700 μL異丙醇，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取白色沉淀，用體積分數(shù)75%的乙醇洗滌1次，置于超凈臺上風干，溶于50 μL DEPC處理水中，電泳檢測。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

根據(jù)GenBank中XOD和18S內(nèi)參基因序列，運用Prime 5.0軟件設計特異性上、下游引物序列。相關基因的引物序列見表2。

表2 XOD目的基因和18S內(nèi)參基因引物參數(shù)Table 2 Parameters of XOD target gene and 18S internal gene primer

1.7.2XODmRNA表達的qRT-PCR檢測 應用StepOneTMReal-Time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix試劑盒。根據(jù)試劑盒說明書進行操作，將調(diào)配的PCR反應液置于8聯(lián)管中，用超凈管蓋封閉，進行RT-PCR反應。PCR反應體系為50 μL：qPCR反應混合物(BestarTMSybrGreen)25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，用ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性120 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；55 ℃ 1 min，55～98 ℃ 0.05 ℃/s，20 ℃ 10 s。利用2-ΔΔCt方法進行相對定量，計算樣品的相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示；采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高蛋白飼糧對肉雞腎功能指標的影響

高蛋白飼糧對肉雞血清腎功能指標的影響如表3所示。

表3 高蛋白飼糧對肉雞血清腎功能指標的影響Table 3 Effects of high protein diet on serum renal function of broilers

由表3可知，試驗開始當日(第0天)，各試驗組肉雞各項指標與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。第7天，與對照組(Ⅰ組)相比，各高蛋白質(zhì)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)肉雞血清UA含量差異不顯著(P>0.05)；與對照組(Ⅰ組)相比，Ⅱ、Ⅲ組肉雞血清中BUN、CREA含量差異不顯著，而Ⅳ組BUN、CREA含量極顯著上升(P<0.01)；與對照組(Ⅰ組)相比，Ⅱ組Ca差異不顯著，而Ⅲ和Ⅳ組Ca含量顯著升高(P<0.05)。第14天，與對照組(Ⅰ組)相比，Ⅱ組肉雞血清中UA、BUN和CREA含量差異不顯著，Ⅲ和Ⅳ組肉雞血清中UA、BUN和CREA含量顯著或極顯著上升(P<0.05或P<0.01)；而各組之間Ca含量差異不顯著(P>0.05)。在試驗期間，各組肉雞血清P、Mg含量變化不顯著(P>0.05)。

2.2 高蛋白飼糧對肉雞脂質(zhì)過氧化指標的影響

由表4可知，第0 天，各高蛋白試驗組肉雞各項指標與對照組差異不顯著(P>0.05)；第7 天，與對照組(Ⅰ 組)相比，各高蛋白組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)肉雞血清MDA含量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，Ⅱ組與Ⅲ組血清·OH和NO含量差異均不顯著(P>0.05)，而Ⅳ組血清·OH、NO含量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；第14 天，Ⅳ組血清MDA、·OH與NO含量較對照組極顯著升高(P<0.01)，其他各組無顯著差異(P>0.05)。與對照組(Ⅰ組)相比，第7 和14 天，Ⅳ組血清SOD活性以及GSH-PX、T-AOC含量顯著下降(P<0.05)；第7天，Ⅲ組血清GSH-PX、T-AOC含量顯著下降(P<0.05)。

表4 高蛋白飼糧對肉雞血清脂質(zhì)過氧化指標的影響Table 4 Effect of high protein diet on serum lipid peroxidation index in broilers

2.3 高蛋白飼糧對肉雞血清XOD活性的影響

由表5可見，試驗第0 天，4組肉雞間黃嘌呤氧化酶活性無顯著差異(P>0.05)；試驗第7天，Ⅱ組肉雞血清XOD活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，而Ⅲ組與Ⅳ組肉雞血清XOD活性顯著高于對照組(P<0.05)；試驗第14天，Ⅳ組肉雞血清XOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，其余各試驗組與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

表5 高蛋白飼糧對肉雞血清XOD活性的影響Table 5 Effect of high protein diet on serum XOD activity in broilers

2.4 XOD基因mRNA表達水平檢測

高蛋白飼糧對肉雞腎組織XOD基因mRNA相對表達量的影響見圖1。

由圖1可知，試驗第14 天時，隨著飼糧中蛋白質(zhì)含量的增加，Ⅲ、Ⅳ組肉雞腎組織中XODmRNA的相對表達量與對照組相比均顯著升高(P<0.05)。

3 討 論

通常情況下，禽類更容易自發(fā)或被誘發(fā)高尿酸血癥，因此在高尿酸血癥模型的建立及研究方面，禽類具有突出地位?；茧u呈現(xiàn)運動能力下降、不能站立等癥狀，這常見于因代謝不均衡、機體內(nèi)電解質(zhì)不平衡引發(fā)的腹瀉癥狀，而內(nèi)臟型痛風表現(xiàn)并不明顯。痛風的禽類糞便為白色稀便，飲食和運動能力減退，有些病雞死亡，解剖病死雞可見到腎臟和輸尿管部位有明顯的病理變化或尿酸鹽沉積[12-13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，高蛋白飼糧飼喂的白羽肉雜雞腎功能指標出現(xiàn)異常變化且呈現(xiàn)增高趨勢，說明隨著蛋白質(zhì)含量的提高，飼糧對雞腎功能的不良影響越來越強[14-15]。

一般認為，動物體內(nèi)Ca和P之間有拮抗作用，適量的高蛋白飼糧可增加肉雞體內(nèi)Ca含量，如果在動物體生長過程中過量飼喂蛋白質(zhì)，反而會導致機體內(nèi)Ca流失，同時會增加腎臟的工作負荷，從而導致腎臟疾病，這在禽類中比較常見[16]。本試驗在第7 天時，Ⅲ、Ⅳ組肉雞血清Ca含量顯著上升，第14 天時，各組血清Ca含量無顯著差異，這可能與大量蛋白質(zhì)的攝入引起腎臟Ca排泄增加有關。禽類攝入大量富含核蛋白質(zhì)和嘌呤堿的蛋白質(zhì)飼料時，飼料中的蛋白質(zhì)在體內(nèi)消化吸收分解最終生成UA，而飼料中高蛋白會引起Ca異位沉著，UA排出受阻，導致血清UA水平升高[17]。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高蛋白組UA顯著升高，該結(jié)果與唐建霞等[18]的研究結(jié)果一致，其原因可推測為飼料中高蛋白會引起Ca異位沉著，UA排出受阻，使體內(nèi)UA升高。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高蛋白飼糧組肉雞血清Mg含量變化不顯著，表明高蛋白質(zhì)的飼喂對Mg含量影響不顯著，與預期相符。CREA是機體組織代謝的產(chǎn)物，血液中的CREA主要由2個途徑產(chǎn)生：外源性和內(nèi)源性，一般CREA的變化以外源性為主[19]。CREA可反映腎臟損害、腎小球濾過率等功能；機體組織代謝的另一個產(chǎn)物為BUN，當BUN超出正常范圍時標志著腎代謝壓力增加，出現(xiàn)了氮質(zhì)血癥，腎功能不全[20-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在大量攝入高蛋白飼糧后，肉雞第7和14天時可以觀察到血清CREA含量增加顯著。

高蛋白飼糧可致雞體內(nèi)Ca含量增加，引發(fā)水和電解質(zhì)代謝紊亂，導致高鈣血癥以及脂質(zhì)過氧化指標發(fā)生變化，最終引發(fā)痛風[18]。由于結(jié)構(gòu)特殊，·OH具有極強的氧化能力。除·OH外，MDA和NO也是反映氧化能力的主要指標。SOD、T-AOC、GSH-Px是體內(nèi)自由基的清除劑，也是機體內(nèi)抗氧化能力的主要指標[22]。本試驗中，在第7和14 天，血清·OH、MDA和NO均呈現(xiàn)280 g/kg粗蛋白組肉雞顯著高于對照組、 220 g/kg粗蛋白組和250 g/kg粗蛋白組的情況，從對照組到高蛋白組呈上升趨勢，并且第7 和14 天·OH、MDA、NO 3個氧化指標均呈現(xiàn)280 g/kg粗蛋白組顯著高于250 g/kg粗蛋白組的情況，說明肉雞血液中的氧化能力有所增強。自由基是動物體內(nèi)自帶的一種物質(zhì)，一般認為自由基會導致機體衰老和功能的減退，而在動物體內(nèi)，當自由基與不飽和脂肪酸等結(jié)合在一起的時候，導致體內(nèi)不飽和脂肪酸直接損壞膜的結(jié)構(gòu)，從而引起機體組織的損傷，自由基如果超過一定的量就會對機體產(chǎn)生毒副作用。氧化功能與抗氧化功能相互抑制，MDA活性經(jīng)常被用作氧化損傷的衡量指標，并被用作反映自由基誘導的脂質(zhì)過氧化水平。T-AOC是反映血清和組織中所有抗氧化劑抗氧化能力的綜合指標，體現(xiàn)了機體抗衰老和抵御外界損傷的能力[23-24]。動物體內(nèi)的自由基和氧化劑會使機體內(nèi)細胞和組織結(jié)構(gòu)受損，影響器官功能，在人體中的主要表現(xiàn)有心腦血管損傷、氧化能力增強或者抗氧化能力減弱，從而造成氧化應激反應[19]。試驗第14 天時，高蛋白組肉雞的氧化指標MDA、NO、·OH均顯著高于對照組，且整體呈現(xiàn)增加趨勢，而抗氧化指標SOD、GSH-Px和T-AOC均較對照組顯著減少，說明機體的氧化能力在增強而抗氧化能力在下降。因此在本試驗中，隨著蛋白質(zhì)含量的增加，機體氧化能力增強而抗氧化能力減弱，呈現(xiàn)劑量依賴性。

XOD作為動物體內(nèi)的一種代謝酶，催化產(chǎn)生超氧自由基和過氧化氫，是體內(nèi)活性氧的一個重要來源[25]。在本試驗中可以觀察到，隨著試驗雞攝入飼糧蛋白質(zhì)含量的增加，XODmRNA表達量也隨之增加，說明高蛋白飼糧的攝入會引起相關基因的表達，且蛋白質(zhì)含量越高基因表達越明顯。此外，XOD與尿酸及自由基的產(chǎn)生密切相關，其可以將代謝產(chǎn)生的次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，再將黃嘌呤氧化成UA，隨著XOD的增加，動物體內(nèi)尿酸沉積越來越明顯，腎臟損傷也越來越嚴重[26]。經(jīng)試驗證實，高蛋白飼糧能提高肉雞XODmRNA表達量，進而導致尿酸及自由基的產(chǎn)生和增加。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼喂高蛋白飼糧可造成肉雞血清腎功能相關指標出現(xiàn)異常，血清XOD活性、腎組織XODmRNA表達量顯著升高，血清氧化指標MDA、NO、·OH含量上升，抗氧化指標T-AOC、GSH-PX、SOD活性下降，產(chǎn)生氧化應激，血清UA、BUN、GREN等指標顯著升高，Ca含量呈上升趨勢，表明高蛋白飼糧會對肉雞造成一定的腎氧化損傷。