黃 露，馬 川，熊 亮，彭 成，郭 力*，周勤梅,

1.成都中醫(yī)藥大學藥學院 教育部中藥材標準化重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學 西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137

3.成都中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，四川 成都 611137

神經退行性疾病的發(fā)病率與年齡密切相關，隨著世界人口老齡化的加速，其發(fā)病率呈現明顯上升趨勢[1]。在《世界老年癡呆癥報告》中指出，未來15年阿爾茲海默病患者人數會增長50%～110%[2]?；颊甙l(fā)病后病情呈現進行性加重，逐漸喪失獨立生活能力，最終因并發(fā)癥而死亡[3]。中藥揮發(fā)油類物質具有上行于竅，開竅的作用，中醫(yī)上也認為“芳香藥行散走竄、芳香上達”[4-5]，現代研究證實芳香類藥物針對神經性疾病具有較好的療效[6-11]。

廣藿香是芳香中藥的代表，為唇形科（Lamiaceae）刺蕊草屬PogostemonDesf.植物廣藿香Pogostemon cablin(Blanco) Benth.的干燥地上部分[12]。國內外研究者已從廣藿香中分離得到90 余個單體化合物，其主要的結構類型包括黃酮類、苯丙素類、萜類、甾體類、生物堿類以及脂肪酸類等[13-17]。而廣藿香油作為廣藿香的主要活性組分，具有抗菌[18]、抗病毒[19]、神經保護[20]等多種藥理活性。Perry 等[21]在芳香療法中發(fā)現廣藿香精油具有安神、保護神經的作用，對于防治神經性疾病有著獨特的優(yōu)勢。前期研究發(fā)現，廣藿香油中分離得到的愈創(chuàng)木烷型倍半萜對具有較好的神經細胞保護活性[20]。因此，本實驗繼續(xù)深入分離廣藿香中倍半萜化合物，得到2個愈創(chuàng)木烷型倍半萜，分別鑒定為 (＋)-(1S,4S,5S,7R,10R)-愈創(chuàng)木烷-5,15-環(huán)氧-11-烯-10-醇[(+)-(1S,4S,5S,7R,10R)-guaiacane-5,15-epoxy-11-ene-10-ol，1]、patchouliguaiol C（2）。其中化合物1 為新化合物，命名為環(huán)氧愈創(chuàng)木醇。并對獲得的化合物進行神經保護作用篩選，結果發(fā)現化合物2 具有顯著的神經保護活性。

1 儀器與材料

Bruker D8 QUEST X 單晶衍射儀（德國Bruker公司）；Waters Synapt G2 高分辨質譜儀（Waters 公司）；安東帕MCP 200 旋光儀（美國安東帕有限公司）；Agilent Cary 600 FTIR 顯微鏡和成像系統（美國Agilent 公司）；Bruker-600 核磁共振儀（德國Bruker 公司）；圓二色譜儀（Chirascan CD 光譜儀）；Búchi Gradient Former B-687 中壓液相色譜儀（Rp C18，43～60 μm）、Búchi Rotavapor R-205 旋轉蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）；Shimadzu UV-260 型紫外光譜儀（日本島津公司）；色譜柱：Agilent C18（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司）；Sephadex LH-20（Amersham Pharmacia 公司）；GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；醋酸乙酯均購自成都科龍試劑廠；色譜甲醇購自天地試劑公司。

DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司）；胎牛血清（Gibico 公司）；細胞培養(yǎng)板（Costar 公司）。Water Jacket CO2孵箱（Thermo Scientific 公司）；Series II Allegra X-12R 離心機（Beckman Coulter 公司）；AE 2000 電子顯微鏡（Motic 公司）；Sunrise 酶標儀（TECAN 公司）；甲基噻唑藍（MTT，Sigma 公司）。SH-SY5Y、PC12 神經細胞株購自江蘇凱基生物細胞庫。

廣藿香藥材于2017年12月采自廣東省陽春縣廣藿香種植基地，經成都中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室高繼海副教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香P.cablin(Blanco) Benth.的全草。標本（SGHX-20171205）現存于成都中醫(yī)藥大學。

2 提取與分離

取干燥的廣藿香藥材地上部分80 kg，采用水蒸氣蒸餾裝置進行提取，收集得到揮發(fā)油，然后用無水硫酸鈉干燥除水，最終得到廣藿香揮發(fā)油405 g。采用硅膠柱色譜（100～200 目）對揮發(fā)油進行薄層色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～0∶100）為流動相進行梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并組成相似的流分，回收溶劑得到21 個洗脫部分（F1～F21）。F18（15.5 g）部分通過反相中壓液相色譜以40%～100%甲醇溶液進行梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并組成相似的流分，得到14份洗脫部分F18-a～F18-n。F18-f部分采用Sephadex LH-20 柱色譜進行分離，以石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）為流動相，分離得到3 個亞組分F18-f-1～F18-f-3。對F18-f-1采用Sephadex HW-40F 柱色譜進行分離，以80%甲醇水為洗脫劑進行洗脫，最后經制備薄層色譜，石油醚-醋酸乙酯（7∶1）展開，得到含化合物1 的混合物，再經過反相半制備高效液相色譜，以69%的甲醇溶液為流動相進行分離純化，最終得到化合物1（6.5 mg，tR＝73 min，體積流量1 mL/min）。F18-h部分采用硅膠柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1～1∶1）梯度洗脫，得到12 個亞組分（F18-h-1～F18-h-12），F18-h-10通過采用反相半制備高效液相色譜法（78%甲醇水溶液）處理組分F18-h-11得到化合物2（10.3 mg，tR＝54 min，體積流量1 mL/min）。

3 結構鑒定

化合物1 的1H-1H COSY 譜顯示H2-6/H-7/H2-8/H2-9、H-4/H3-14/H-1/H2-2/H2-3 的相關信號，揭示出1 個連續(xù)的質子偶合體系（圖1）。HMBC 譜中，Me-14 與C-3、C-4、C-5 相關；H-1 與C-2、C-3、C-10 相關；H-15 與C-1、C-5、C-9、C-10 相關；H-7 與C-6 和C-8 相關；H-12 與C-7 和C-11相關，表明含氧季碳取代于C-10 位，且C-15 與C-5之間形成1 個五元環(huán)醚。

化合物1 的相對構型通過NOESY 譜確定，其中H-1 與H-6a 和H-9a 相關；H-15 與H-3a、H-6b和H-9b 相關；H2-12 與H-9b 相關，H-3a 與H3-14相關（圖1），說明H-6a、H-1、OH-10、H-4 和H-7位于環(huán)系的同側；H3-14 與H-15 和isopropenyl-7 位于另外一側。同時對該化合物進行了單晶測定，見圖2。進一步通過計算ECD 確定化合物1 的絕對構型。在乙腈中使用等電聚焦連續(xù)極化（IEF-PCM）溶劑化模型針對 1a (1S,4S,5S,7R,10R) 和 1b(1R,4R,5R,7S,10S) 在CAM-B3LYP/DGDZVP 級計算得到的ECD 光譜。通過ECD 光譜比較，計算得出的1a (1S,4S,5S,7R,10R) ECD 譜與實驗ECD 譜非常吻合。因此，將化合物1 的絕對構型確定為1S,4S,5S,7R,10R。最終化合物鑒定為(＋)-(1S,4S,5S,7R,10R)-愈創(chuàng)木烷-5,15-環(huán)氧-11-烯-10-醇。

化合物1 的X-ray 單晶衍射數據：C15H24O2,M＝236.34 g/mol，單斜晶系（monoclinic），手性非心空間群（P21）；a＝7.048(4)×10?7mm,b＝10.887(4)×10?7mm,c＝9.457(5)×10?7mm,α＝90°,β＝102.96(3)°,γ＝90°,V＝707.2(6) ×10?7mm3,T＝298(2) K,Z＝2,μ(Cu Kα) ＝0.558 mm?1,12 502 次單晶反射收集的數據（reflections measured），其中收集到的2285 個數據為較完整的可用數據（independent reflections）；Rint＝0.037 7,R1＝0.036 4 (I＞2σ(I)),wR(F2)＝0.092 6(I＞2σ(I)),R1＝0.041 6 (all data),wR(F2)＝0.097 1(all data),F2＝1.084,Flack parameter＝?0.20(15)。

表1 化合物1 的碳、氫核磁共振波譜數據Table 1 1H-NMR (600 MHz,acetone-d6) and 13C-NMR (150 MHz,acetone-d6) data of compound 1

圖1 化合物1 的結構及主要的1H-1H COSY、HMBC 和NOESY 信號Fig.1 Structure and key correlations of 1H-1HCOSY,HMBC and NOESY of compound 1

圖2 化合物1 的X-ray 單晶衍射結構 (左) 和ECD 圖 (右)Fig.2 X-ray crystal structure (left) and ECD (right) of compound 1

化合物2：白色粉末，10%硫酸乙醇顯紫色；HR-ESI-MSm/z:259.168 5 [M＋Na]+（計算值259.167 4，C15H24O2Na）；1H-NMR (600 MHz,Acetone-d6)δ:5.17 (1H,brs,H-15a),4.91 (1H,brs,H-15b),4.65 (1H,brs,H-12a),4.59 (1H,brs,H-12b),4.46 (1H,q,J=6.6 Hz,H-2a),2.49 (1H,m,H-4),2.47 (1H,m,H-9a),2.22 (1H,ddd,J=13.2,6.0,4.2 Hz,H-9b),2.09 (1H,m,H-7),2.05 (1H,m,H-5),1.87(1H,m,H-8a),1.80 (1H,ddd,J=12.6,7.8,6.6 Hz,H-3a),1.68 (3H,brs,H3-13),1.67 (1H,ddd,J=12.6,7.8,6.6 Hz,H-3b),1.50 (1H,brd,J=13.8 Hz,H-6a),1.36 (1H,m,H-8b),1.12 (1H,ddd,J=13.8,12.0,10.8 Hz,H-6b),0.87 (3H,d,J=7.2 Hz,CH3-14)；13CNMR (150 MHz,Acetone-d6)δ:154.7 (C-10),152.5(C-11),111.9 (C-15),108.6 (C-12),84.4 (C-1),74.0(C-2),54.6 (C-5),49.7 (C-7),41.4 (C-3),38.0 (C-8),32.9 (C-9),32.8 (C-4),31.9 (C-6),20.5 (C-13),16.8(C-14)。以上數據與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物2 為patchouliguaiol C。

4 神經保護作用篩選

采用MTT 法測定化合物1 和2 對β 淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein，Aβ1-42）損傷人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 和H2O2損傷PC12 細胞的作用[22-23]。

SH-SY5Y 細胞接種于DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至對數生長期，取出離心。接種SH-SY5Y 細胞于96 孔板中，每孔1×105個細胞，其中DMEM 含有10%胎牛血清（100 μL）。將SH-SY5Y 細胞與樣品一起預孵育24 h，最終濃度為3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，然后分別用25 μmol/L Aβ1-42處理4 h。培養(yǎng)期后，向各孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h。以0.1%DMSO為對照，50 μmol/L 維生素E 用作陽性對照，使用酶標儀在490 nm 處測量吸光度（A）。每個測定重復3 次，計算細胞存活率。

當PC12 細胞處于對數生長期進行收集，PC12細胞接種于DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至對數生長期，取出離心。接種PC12 細胞于96 孔板中，每孔1×105個細胞，其中DMEM 含有10%胎牛血清（100 μL）。將PC12 細胞與樣品一起預孵育24 h，最終濃度為3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，然后分別用400 μmol/L H2O2處理4 h。培養(yǎng)期后，向各孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h。以0.1%DMSO 為對照，50 μmol/L 維生素E用作陽性對照，以使用酶標儀在490 nm 處測定A，每個測定重復3 次，按照以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率＝A給藥/A對照

由圖3、4 可知，化合物2 在50 μmol/L 濃度下，對Aβ1-42損傷SH-SY5Y 細胞和H2O2損傷PC12神經細胞具有顯著的保護作用，存活率分別為（79.57±4.33）%和（69.14±2.55）%。而化合物1 在3.13～50 μmol/L 濃度內，對Aβ1-42 損傷SH-SY5Y 細胞和H2O2損傷PC12 神經細胞未表現出明顯作用。

5 討論

圖3 化合物1 和2 對Aβ1-42 損傷SH-SY5Y 神經細胞的影響Fig.3 Effect of compounds 1 and 2 against Aβ1-42-damage in SH-SY5Y cells

圖4 化合物1 和2 對H2O2 損傷PC12 神經細胞的影響Fig.4 Effect of compounds 1 and 2 against H2O2-damage in PC12 cells

神經退行性疾病是由神經元和（或）其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，出現功能障礙的一種老年人常發(fā)疾病[24]，作為當今研究的重點，科學家尚未發(fā)現療效很好的藥物。結合中醫(yī)藥“芳香藥行散走竄、芳香上達”的理論，選擇芳香中藥的代表廣藿香為研究對象，從中探索對神經性疾病具有較好作用的物質。通過對廣藿香的揮發(fā)性成分進行分離純化以及活性篩選，發(fā)現化合物2 對Aβ1-42損傷SH-SY5Y 和H2O2損傷PC12 神經細胞均表現出顯著的保護作用，為現代藥物的研究與開發(fā)提供參考。

廣藿香油中含有豐富的愈創(chuàng)木烷型倍半萜，同時該類型化合物也是自然界中存在的重要天然產物類型，受到廣大醫(yī)藥研究者的密切關注[25]。愈創(chuàng)木烷型倍半萜含有多個手性中心，其絕對構型的確定成為該類型成分結構鑒定的難點。本研究聯合HR-ESI-MS、NMR、ECD 以及X 單晶衍射等多種技術手段對新化合物1 進行結構鑒定。不僅豐富了廣藿香油的化學組成，同時也為愈創(chuàng)木烷型倍半萜的結構鑒定提供可靠的數據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突