歐陽瑒, 遲 磊, 徐 超, 趙欣捷, 崔振澤*

(1. 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市兒童醫(yī)院, 遼寧 大連 116012)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是單股負(fù)鏈RNA病毒。它是引發(fā)毛細(xì)支氣管炎等呼吸道感染的病原之一[1]。該病毒對(duì)嬰幼兒的傷害尤其大[2],感染后極易發(fā)展為呼吸衰竭和重度肺炎[3],嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。目前全球尚無統(tǒng)一有效的治療方法或疫苗。西藥利巴韋林是一種核苷類藥物,可插入病毒的RNA基因鏈中導(dǎo)致基因錯(cuò)誤突變,是一種廣譜的抗病毒藥[4]。已有研究證明利巴韋林對(duì)RSV感染有療效[5,6]。它目前已被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)以霧化形式用于治療RSV感染[7],但是利巴韋林也被報(bào)道易導(dǎo)致并發(fā)癥[8]和耐藥性突變[9]。傳統(tǒng)中藥用于RSV感染的治療在中國有著廣泛的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)。《攝生眾妙方》記載了中藥定喘湯的配方,該藥物可用于治療咳嗽喘息。定喘湯可通過抑制病毒復(fù)制減少病毒對(duì)機(jī)體的傷害[10]。同時(shí)它也能修復(fù)RSV感染造成的機(jī)體天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的紊亂,提高機(jī)體自身免疫力以抵抗病毒[11]。此外定喘湯也可以通過下調(diào)小鼠TLR4和NF-κB mRNA的表達(dá),減少因RSV感染引起的炎癥反應(yīng)[12]。

生物體內(nèi)代謝物的變化能及時(shí)反映出機(jī)體正在發(fā)生的變化,而代謝組學(xué)是研究代謝物變化規(guī)律的科學(xué),能系統(tǒng)地闡述機(jī)體代謝組的動(dòng)態(tài)改變[13]。目前代謝組學(xué)已經(jīng)被用于研究RSV感染后細(xì)胞[14]、尿液[15]、血液和組織[16]中的代謝物改變。研究人員通過核磁共振代謝組學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)RSV感染嬰兒的尿液中有13種代謝物與健康對(duì)照相比發(fā)生了顯著性變化,包括1-甲基煙酰胺、4-脫氧蘇糖酸、肌酸、2-氨基丁酸和琥珀酸等[15]?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)平臺(tái)對(duì)RSV肺炎小鼠模型的脂質(zhì)代謝組學(xué)研究表明,小鼠肺組織和血漿中分別有多種脂質(zhì),包括磷脂、鞘脂、脂肪酸等發(fā)生代謝異常[16]。代謝物組學(xué)也被用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)RSV感染的治療效果以及藥物治療機(jī)理研究[17,18]?；贚C-MS的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)中成藥金欣口服液可以改善RSV感染后血漿和肝組織中氨基酸代謝以及脂質(zhì)代謝的紊亂[17]?；跉庀嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)的研究發(fā)現(xiàn)中藥黃芩中天然活性成分黃芩素能改善RSV感染小鼠的肝臟組織中天冬氨酸、甘氨酸和磷酸肌酐等相關(guān)代謝通路的失衡[18]。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)了定喘湯能有效改善RSV感染后多種膽汁酸異常,進(jìn)而保護(hù)肝腸循環(huán),維持腸道代謝穩(wěn)定[19]。

本研究采用基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)方法[20],研究大鼠感染RSV后血漿代謝的改變及中藥定喘湯對(duì)RSV感染大鼠的血液代謝異常的治療效果,并通過研究定喘湯的3種分解劑,考察定喘湯的主要藥效來源,以期能為RSV的藥物治療研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1大鼠、病毒和藥品信息

SPF級(jí)Wistar幼齡大鼠(3周,遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司),呼吸道合胞病毒(RSV,中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室),中藥組成和制備過程與我們之前發(fā)表的工作[21]一致。西藥利巴韋林來自四川百利藥業(yè),用生理鹽水制成10 mg/mL備用。所有中藥材均來自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。定喘湯組由麻黃9 g、杏仁9 g、半夏9 g、蘇子6 g、黃芩12 g、桑白皮9 g、白果9 g、款冬花9 g、甘草3 g組成;宣法分解劑由麻黃9 g、白果9 g組成;降法分解劑由杏仁9 g、半夏9 g、蘇子6 g、款冬花9 g組成;清法分解劑由黃芩12 g、桑白皮9 g組成。將以上藥物按照傳統(tǒng)方法水煎2次混合后,制成含生藥2 g/mL的藥液備用。

1.1.2試劑

流動(dòng)相和內(nèi)標(biāo)均為UPLC級(jí)別。其中,乙腈和甲醇來自Merck公司(達(dá)姆施塔特,德國),甲酸和內(nèi)標(biāo)均來自Sigma-Aldrich公司(密蘇里州圣路易斯,美國)。將內(nèi)標(biāo)配制于甲醇中用于血漿代謝物的提取。內(nèi)標(biāo)的種類及含量如下:色氨酸-d5(L-tryptophan-d5, 4.26 μg/mL)、苯丙氨酸-d5(L-phenyl-d5-alanine, 3.61 μg/mL)、膽酸-d4(cholic acid-d4, 1.85 μg/mL)、鵝脫氧膽酸-d4(chenodeoxycholic acid -d4, 1.48 μg/mL)、棕櫚酸-d3(palmitic acid-d3, 2.50 μg/mL)、硬脂酸-d3(stearic acid-d3, 2.50 μg/mL)、肉堿C2∶0-d3(carnitine C2∶0-d3, 0.16 μg/mL)、肉堿C10∶0(carnitine C10∶0-d3, 0.10 μg/mL)、肉堿C16∶0-d3(carnitine C16∶0-d3, 0.15 μg/mL)、膽堿-d4(choline-d4, 0.26 μg/mL)、溶血磷脂酰膽堿19∶0(lysophosphatidylcholine 19∶0, LPC 19∶0, 0.75 μg/mL)、磷脂酰膽堿38∶0(phosphatidylcholine 38∶0, PC 38∶0, 0.63 μg/mL)和鞘磷脂12∶0(sphingomyelin 12∶0, SM 12∶0, 0.13 μg/mL)。

1.1.3主要設(shè)備

全外排二級(jí)生物安全柜(SG403TXCE, Baker公司,桑福德,美國); 96孔除蛋白板(Phenomenex公司,托蘭斯,美國); 96孔板正壓裝置(Waters公司,米爾福德,美國); Waters ACQUITY超高效液相色譜(Waters公司,米爾福德,美國)串聯(lián)TripleTOF 5600質(zhì)譜(AB SCIEX公司,弗雷明漢,美國)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣本收集

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。將42只Wistar大鼠隨機(jī)平均分為7組,分別為正常組(簡(jiǎn)寫Z)、模型組(簡(jiǎn)寫M)、利巴韋林組(簡(jiǎn)寫L)、定喘湯組(簡(jiǎn)寫D)、宣法組(簡(jiǎn)寫D-X)、降法組(簡(jiǎn)寫D-J)和清法組(簡(jiǎn)寫D-Q),每組6只。模型組和各干預(yù)組連續(xù)3天滴鼻接種RSV(0.1 mL/只)。正常組在相同條件下連續(xù)3天接種等量生理鹽水。各干預(yù)組在第1次滴鼻2 h后開始灌胃給藥干預(yù),正常組和模型組在相同條件下給予生理鹽水灌胃,各組持續(xù)灌胃干預(yù)7天。其中利巴韋林組給藥量為每天0.1 mL/kg的利巴韋林藥液,作為陽性對(duì)照。定喘湯組及其分解劑組每天分別給予2 g/kg中藥藥液。取各組第0天(接種RSV前的一天)、第3天和第7天的眼底血,加入低分子肝素抗凝,以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min。取上層血漿保存在-80 ℃,用于后續(xù)的代謝組學(xué)分析。按照相同分組、感染和喂養(yǎng)方式處理另外兩批老鼠,分別于第3天和第7天處死,提取肺組織采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[22]檢測(cè)RSV mRNA表達(dá)(即病毒載量)。計(jì)算第7天處死大鼠的肺組織占體重的百分比,得到第7天的肺指數(shù)。

圖 1 大鼠喂養(yǎng)、感染和給藥過程圖示Fig. 1 Schematic representation of rat feeding, infection, and dosage methodRSV: respiratory syncytial virus.

1.3 血漿樣品預(yù)處理

大鼠血漿從-80 ℃取出后于冰水中融化,渦旋1 min。所有大鼠樣品隨機(jī)排序進(jìn)行預(yù)處理與檢測(cè)。處理方法如下:取50 μL血樣與200 μL含內(nèi)標(biāo)的甲醇于96孔板孔內(nèi)。室溫下渦旋10 min混合均勻后靜置10 min。用正壓過濾的方式去除蛋白。將過濾后的提取溶液真空低溫凍干,并保存在-80 ℃冰箱。每個(gè)樣品用50 μL體積比為1∶4的甲醇-水溶液復(fù)溶后進(jìn)行LC-MS分析。另將每個(gè)大鼠血漿取10 μL混合均勻,制備為質(zhì)量控制(QC)樣品。QC樣品的處理同大鼠血漿樣品。每檢測(cè)10個(gè)大鼠血漿樣品后檢測(cè)一個(gè)QC樣品,以評(píng)估檢測(cè)過程的穩(wěn)定性。

1.4 UPLC-MS條件

分析過程采用我們之前建立的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速分析技術(shù)[20],分析柱使用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司,米爾福德,美國)。色譜的流動(dòng)相A相和B相分別為0.1%(v/v)的甲酸水溶液和0.1%(v/v)的甲酸乙腈溶液。流速為0.4 mL/min。柱溫為60 ℃。進(jìn)樣體積為5 μL。初始梯度為95%的A相,平衡0.5 min。然后在1.5 min內(nèi)線性變換至60%的A相。再之后在6 min內(nèi)線性變換至0%的A相,并保持2 min。最后在0.1 min內(nèi)線性變化為95%的A相,并平衡1.9 min?？偟囊合嗌V分離時(shí)間為12 min。質(zhì)譜的鞘氣和氣簾氣壓力分別為379和241 kPa。質(zhì)譜掃描范圍為m/z80～1 000, 信息依賴型采集(IDA)模式掃描范圍為m/z60～1 000。正離子模式下,噴霧電壓為5.5 kV,離子源溫度為550 ℃。負(fù)離子模式下,噴霧電壓為-4.5 kV,離子源溫度為450 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

用MarkerView軟件(1.2.1版本,AB SCIEX公司,康科德,加拿大)提取離子原始峰表。用80%規(guī)則[23]對(duì)離子峰表預(yù)處理,并采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。將在QC中RSD值小于30%的離子導(dǎo)入SIMCA-P軟件(11.0版本,Umetrics AB公司,于默奧,瑞典)進(jìn)行多變量分析,得到主成分分析(PCA)模型。將各組校正到正常組后,在IBM SPSS軟件(25.0版本,IBM公司,阿蒙克,美國)中對(duì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫[24]定性的150個(gè)代謝物做t檢驗(yàn)。其中p值小于0.05的為有顯著性差異。在MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站進(jìn)行通路分析。采用Multi Experiment Viewer軟件(4.7.4版本)[25]繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床指標(biāo)評(píng)價(jià)

病毒載量和肺指數(shù)可監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程,判斷藥物療效。對(duì)病毒載量和肺指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),考察各組大鼠與模型組之間的差異,結(jié)果見圖2。如圖2a、2b所示,模型組第3天和第7天的病毒載量分別為2.38±0.07、1.26±0.05,說明第3天RSV感染程度顯著高于第7天;利巴韋林組和定喘湯組的病毒載量與相同時(shí)間點(diǎn)模型組比較都有顯著性下降,且這兩個(gè)用藥組之間無顯著差異;各中藥分解劑組與模型組相比,清法組第3天和第7天的病毒載量顯著性降低,宣法組的病毒載量在給藥后的第7天也顯著性減少。

圖 2 各組大鼠的平均病毒載量和平均肺指數(shù)柱狀圖Fig. 2 Histogram of mean viral load and mean lung index of rats in each group a. The mean viral load on day 3; b. The mean viral load on day 7; c. The mean lung index on day 7; The differences between model group and other groups were assessed by independent samples t-test, and metabolites with p<0.05 were marked by stars; Error bars indicate SD values. The letters Z, M, L, D, D-X, D-J, and D-Q represent normal group, RSV model group, ribavirin group, asthma-relieving decoction group, ascending (xuan) therapy group, descending (jiang) therapy group and pyretic clearing (qing) therapy group, respectively.

圖2c表明模型組與正常組相比,第7天的肺指數(shù)顯著增高。利巴韋林和定喘湯組與模型組相比,都顯著降低了肺指數(shù),且兩個(gè)用藥組之間并無顯著差異,說明這兩種藥物都對(duì)RSV感染造成的肺指數(shù)增加有一定療效。3種中藥分解劑中僅宣法分解劑組顯著性降低了肺指數(shù)。

2.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)

本研究采用的是我們已建立的基于LC-MS技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)方法,該方法能提高樣品處理和分析通量,方法建立及考察過程參考文獻(xiàn)[20]?；诜前邢虼x組學(xué)方法對(duì)正常組、模型組、利巴韋林組、定喘湯組、宣法組、降法組和清法組共計(jì)42只大鼠的血漿進(jìn)行分析,在Waters ACQUITY超高效液相色譜-串聯(lián)TripleTOF 5600質(zhì)譜上采用正、負(fù)離子兩種模式檢測(cè)。正離子模式和負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到1 835和1 906個(gè)離子。QC樣品中RSD值小于30%的離子累計(jì)響應(yīng)分別占正、負(fù)離子模式總響應(yīng)的84.9%和92.9%(如圖3所示),該結(jié)果表明樣品處理和檢測(cè)過程穩(wěn)定可靠。

圖 3 (a)正離子和(b)負(fù)離子檢測(cè)模式下質(zhì)量控制(QC)樣品的RSD值Fig. 3 RSDs of quality control (QC) samples in (a) positive and (b) negative ion modes

2.3 模式識(shí)別分析

為了從代謝物組學(xué)角度整體評(píng)價(jià)藥物的藥效,本研究對(duì)第0天、第3天和第7天樣本數(shù)據(jù)分別建立PCA模型,得分圖見圖4。從圖4a可以看到,第0天各組無明顯分離趨勢(shì),說明造模前各組樣本無差異。如圖4b所示,第3天時(shí)正常組和模型組顯示出明顯分離趨勢(shì);模型組、清法組和降法組有聚合趨勢(shì);定喘湯組、宣法組和利巴韋林組有聚集趨勢(shì),且與模型組有明顯的分離趨勢(shì),說明定喘湯、宣法分解劑與利巴韋林對(duì)RSV感染大鼠產(chǎn)生的代謝調(diào)控效果類似,而清法分解劑和降法分解劑對(duì)RSV感染大鼠的代謝調(diào)控不顯著。通過圖4b中PCA得分圖顯示的宣法組與定喘湯組聚集在同一區(qū)域,我們推測(cè)宣法分解劑在定喘湯的代謝調(diào)控功能中起主要作用,可能為定喘湯的主要藥效來源。與第3天相比,第7天時(shí)各組與正常組間呈現(xiàn)明顯聚攏趨勢(shì)(如圖4c所示),說明感染RSV第7天時(shí),各組的代謝組趨于正常。

圖 4 (a)第0天、(b)第3天和(c)第7天的主成分分析(PCA)得分圖Fig. 4 Score plots of principal component analysis (PCA) of (a) day 0, (b) day 3, and (c) day 7

2.4 關(guān)鍵代謝物篩選及變化規(guī)律

為了排除生長(zhǎng)、取血等過程對(duì)大鼠代謝組的影響,將各組的代謝物峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)校正到相對(duì)應(yīng)天數(shù)的正常組數(shù)據(jù)。為了找出感染RSV引起的代謝改變,對(duì)模型組第3天和第0天的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn),得到并定性出83個(gè)發(fā)生顯著性變化的代謝物(p< 0.05)。將這83個(gè)與RSV感染密切相關(guān)的代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站進(jìn)行通路分析,發(fā)現(xiàn)多條代謝通路在RSV感染后的第3天存在明顯改變,改變的通路有氨酰基-tRNA生物合成,苯丙氨酸的代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,初級(jí)膽汁酸的生物合成,鞘磷脂代謝等(見圖5)。

接下來我們重點(diǎn)關(guān)注各藥物組對(duì)這83個(gè)因RSV感染而顯著性改變代謝物的調(diào)節(jié)。分別對(duì)各組第3天和第7天與自身第0天的代謝組數(shù)據(jù)做配對(duì)t檢驗(yàn)。第3天時(shí),由于接種病毒的同時(shí)給予藥物干預(yù),與RSV感染引起的變化趨勢(shì)相同且有顯著性差異(p< 0.05)的代謝物則認(rèn)為藥物干預(yù)對(duì)該代謝物無顯著性藥效,否則即藥物對(duì)該代謝物產(chǎn)生了藥效。與RSV感染變化趨勢(shì)相同且有顯著性差異的代謝物個(gè)數(shù)總結(jié)于圖6a。如圖6a所示,第3天時(shí)各干預(yù)組中與RSV感染有相同變化趨勢(shì)的代謝物的個(gè)數(shù)相對(duì)于模型組都大大減少,說明各給藥組均可對(duì)代謝物產(chǎn)生藥效。第7天時(shí)(如圖6b所示),由于已經(jīng)停止接種病毒,模型組中與RSV感染有相同變化趨勢(shì)的代謝物個(gè)數(shù)減少,說明感染RSV后,即使未給予藥物治療,機(jī)體也能產(chǎn)生一定的自愈能力,這符合病毒感染的臨床實(shí)際。而定喘湯組和利巴韋林組中有顯著性差異的代謝物明顯少于模型組和3個(gè)中藥分解劑組,說明定喘湯組和利巴韋林組在感染第7天時(shí)對(duì)與RSV感染密切相關(guān)的代謝物產(chǎn)生藥效,且藥效優(yōu)于各中藥分解劑組。

圖 5 RSV感染對(duì)大鼠代謝通路的影響Fig. 5 Effects of RSV infections on the metabolic pathways in rats

圖 6 (a)第3天和(b)第7天時(shí)各組中與RSV感染有相同變化趨勢(shì)的顯著性代謝物的個(gè)數(shù)Fig. 6 Numbers of significant metabolites in each group that had similar changes with RSV infection on (a) day 3 and (b) day 7

根據(jù)配對(duì)t檢驗(yàn)的結(jié)果,第3天時(shí)利巴韋林組或定喘湯組有藥效的代謝物總共為56個(gè)。為了闡述藥物治療改變的代謝物的種類及規(guī)律,將第3天這56個(gè)代謝物校正到相對(duì)應(yīng)天數(shù)正常組的相對(duì)強(qiáng)度顯示于圖7。圖7中“1”表示在RSV感染后的模型組的第3天相對(duì)第0天顯著性累積的代謝物;“2”表示在RSV感染后的模型組的第3天相對(duì)第0天顯著性下調(diào)的代謝物;“1-a”和“2-a”表示在定喘湯組和利巴韋林組的第3天相對(duì)第0天均無顯著性差異的代謝物,提示這兩種藥物均對(duì)這部分因RSV感染而異常的代謝物具有修正效果。“1-b”和“2-b”表示僅利巴韋林能修正的異常代謝物,它們?cè)诶晚f林組的第3天相對(duì)第0天無顯著性差異,而定喘湯對(duì)這些代謝物無明顯調(diào)節(jié)作用。“2-c”表示僅定喘湯能修正的異常代謝物,它們?cè)诙ù瓬M的第3天相對(duì)第0天無顯著性差異,而利巴韋林無明顯調(diào)節(jié)作用?！?-d”表示定喘湯和利巴韋林均可調(diào)節(jié)的代謝物,它們?cè)诟腥綬SV后的第3天顯著性下調(diào),在利巴韋林組的第3天相對(duì)第0天無顯著性差異,但在經(jīng)定喘湯干預(yù)后第3天反而顯著性累積。

如圖7的“1”部分所示,與正常組相比,模型組中氨基酸(賴氨酸(lysine)、酪氨酸(tyrosine)、色氨酸(tryptophan)和苯丙氨酸(phenylalanine))、部分初級(jí)膽汁酸(膽酸(CA)、牛黃膽酸(TCA)和牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA))、?；鈮A和鞘磷脂等多種代謝物的含量上調(diào)。在圖7的“2”部分中,與正常組相比,模型組中精氨酸、部分次級(jí)膽汁酸(脫氧膽酸(DCA)、熊去氧膽酸(UDCA)和甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA))、有機(jī)酸(檸檬酸(citric acid)、羥基己酸(hydroxycaproic acid)和松香酸(abietic acid))、腸道菌群相關(guān)代謝物(硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)、哌啶酮(piperidone)和吲哚丙酸(indolepropionic acid))、溶血磷脂酰磷脂膽堿以及溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)等多種代謝物下調(diào)。這些代謝物可能與RSV致病過程密切相關(guān)。

氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和賴氨酸等在感染RSV后的第3天顯著性積累,而精氨酸顯著性降低(如圖7的“a”部分所示)。氨基酸異常提示RSV感染造成三羧酸循環(huán),糖酵解和尿素循環(huán)等多個(gè)代謝通路改變[26]。這些氨基酸在定喘湯組和利巴韋林組,與模型組相比,其含量與正常組含量更接近。它們?cè)诙ù瓬M和利巴韋林組內(nèi)第3天和第0天間均無顯著性差異,說明這兩種藥物均能有效修復(fù)RSV感染引起的多條氨基酸相關(guān)通路異常。此外,圖7也顯示了代謝物在給予3種中藥分解劑干預(yù)后的含量變化。3種分解劑中,宣法組與定喘湯組相同,氨基酸含量與正常組接近,在組內(nèi)第3天和第0天間均無顯著性差異;降法組中各氨基酸的含量與模型組接近,在組內(nèi)第3天和第0天間均存在顯著性差異;清法組中部分氨基酸含量與正常組接近(如圖7的“a”部分)。通過該結(jié)果推測(cè)定喘湯對(duì)氨基酸的修正藥效主要來自于宣法分解劑,且3種分解劑中降法分解劑對(duì)氨基酸的修正效果最弱。

圖 7 與RSV感染相關(guān)的56個(gè)代謝物在各組第3天含量的熱圖Fig. 7 Heat map of 56 metabolites related to RSV infection in each group on day 3 Numbers “1” and “2” represent metabolites whose levels were significantly up-regulated or down-regulated on day 3 after RSV infection, respectively; The letter “a” indicates abnormal metabolites that were corrected by using both ribavirin and asthma-relieving decoction; “b” indicates abnormal metabolites that were only corrected by using ribavirin; “c” indicates abnormal metabolites that were only corrected by using asthma-relieving decoction; “d” indicates abnormal metabolites that were regulated by using both ribavirin and asthma-relieving decoction. Abbreviation: CA: cholic acid; TCA: taurocholic acid; TUDCA: tauroursodesoxycholic acid; LPC: lysophosphatidylcholine; SM: sphingomyelin; PC: phosphatidylcholine; TCDCA: taurochenodexycholic acid; DCA: deoxycholic acid; UDCA: ursodeoxycholic acid; GUDCA: glycoursodeoxycholic acid; LPE: lysophosphatidylethanolamine; FFA: free fatty acid.

氨基酸也可在腸道中經(jīng)由腸道菌群分解代謝,如色氨酸通過腸道生孢梭菌分解產(chǎn)生吲哚丙酸進(jìn)入宿主血液[27]。吲哚丙酸在模型組中顯著性降低,說明感染RSV后大鼠的腸道菌群代謝發(fā)生改變,先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂[27]。吲哚丙酸在利巴韋林組、定喘湯組及3種分解劑的第3天和第0天間均無顯著性差異,說明各藥物均有修正腸道菌群和免疫系統(tǒng)異常的藥效。

膽汁酸也是和腸道菌群相關(guān)的代謝物,它們能在腸道和肝臟之間進(jìn)行肝腸循環(huán)[28]。我們之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RSV感染會(huì)引起膽汁酸中CA、TCA和牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的異常累積,而定喘湯可有效修正這些膽汁酸水平的異常[19]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)次級(jí)膽汁酸中的DCA、UDCA和GUDCA在RSV感染后的模型組異常下調(diào)(如圖7的“2-a”部分所示),且這6種膽汁酸在定喘湯組和利巴韋林組的第3天和第0天間均無顯著性差異。從熱圖可以看到,與模型組相比,它們?cè)诙ù瓬M和利巴韋林組的第3天的含量均更接近正常組,說明這兩種藥物均有助于維持腸道代謝和肝腸循環(huán)的穩(wěn)定。此外如圖7所示,大鼠服用3種中藥分解劑后,膽汁酸的含量相比模型組更接近正常組,且這6種膽汁酸在宣法組和降法組的第3天和第0天間均無顯著性差異(p>0.05)。

至于脂類代謝物,相對(duì)正常組來說,SM的含量在模型組中顯著性累積,而LPE、LPC和PC的含量顯著性下調(diào)(如圖7所示)。研究表明脂質(zhì)水平與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[29]。感染病毒后,機(jī)體可通過炎癥反應(yīng)來抵抗病毒入侵,幫助組織修復(fù)等[30]。給予定喘湯和利巴韋林可修正部分脂類異常,使其含量更接近正常組(如圖7所示),提示兩種藥物可能通過抵御病毒,降低了機(jī)體自身炎癥反應(yīng)。此外,如圖7的“2-d”所示,對(duì)于在模型組中下調(diào)的一部分LPC和PC,利巴韋林和定喘湯均同時(shí)具有調(diào)節(jié)效果。但這些代謝物僅在經(jīng)利巴韋林干預(yù)后在第3天和第0天間無顯著性差異,在經(jīng)定喘湯干預(yù)后反而顯著性累積。如圖7所示,在3種分解劑中,定喘湯組和宣法組的脂質(zhì)變化趨勢(shì)更為接近,說明定喘湯對(duì)脂質(zhì)代謝物的影響主要來源于宣法分解劑。值得一提的是,如圖7的“2”部分所示,清法組中脂類代謝物的含量明顯低于其他各組,推測(cè)清法分解劑有降低大鼠血脂的功效。

?；鈮A(尤其是中長(zhǎng)鏈肉堿)的含量在模型組相對(duì)正常組累積,而在利巴韋林組中的含量更接近正常組,且利巴韋林組在第3天和第0天間無顯著性差異(如圖7“1-b”部分所示)。?；鈮A與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)[31,32],而且有研究人員發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈?；鈮A累積可能導(dǎo)致肺功能損傷[33]。我們推測(cè)利巴韋林或可通過調(diào)節(jié)?；鈮A來維持能量代謝的穩(wěn)定,并減少肺損傷。對(duì)于各中藥組,雖然?；鈮A在定喘湯組和宣法組中的含量與模型組相似,但降法組和清法組中酰基肉堿的含量相對(duì)模型組明顯下調(diào),接近正常組(見圖7“1-b”部分)。

此外,如圖7的“2-c”部分所示,有機(jī)酸(羥基己酸、松香酸)在模型組中與正常組相比顯著性下調(diào),在定喘湯組中的含量與正常組接近,而在利巴韋林組與模型組接近。該結(jié)果提示與利巴韋林組相比,定喘湯有更強(qiáng)的維持有機(jī)酸類代謝物穩(wěn)定的效果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了大鼠感染RSV后的代謝異常,考察了中藥定喘湯對(duì)RSV感染大鼠代謝異常的調(diào)控作用,并比較了定喘湯的3種分解劑的藥效。結(jié)果表明RSV感染可造成大鼠膽汁酸、氨基酸、?；鈮A、脂類等多種代謝物發(fā)生紊亂。定喘湯能修正RSV引起的膽汁酸、氨基酸、有機(jī)酸水平異常,腸道菌群和免疫系統(tǒng)紊亂等,對(duì)于脂類代謝物的異常也有一定的改善效果。在3種中藥分解劑中,定喘湯與宣法分解劑對(duì)代謝組的調(diào)控作用更為接近,可以推測(cè)宣法分解劑的組成成分麻黃和白果可能為定喘湯的主要藥效來源。本研究雖然能為RSV感染的臨床治療提供一定的指導(dǎo)依據(jù),但藥物的作用機(jī)制仍然需要更進(jìn)一步的研究。