方 力, 邱鳳梅, 余新威

(1. 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室(舟山市疾病預(yù)防控制中心), 浙江 舟山 316021; 2. 岱山縣疾病預(yù)防控制中心, 浙江 岱山 316200)

我國山區(qū)眾多,野生菌類資源豐富、種類繁多,因誤食野生毒蘑菇中毒事件時有發(fā)生,并可引起嚴重甚至致命的中毒。鵝膏肽類毒素是一類環(huán)狀多肽類毒素,由該毒素引起的中毒占毒蘑菇中毒死亡病例的90%以上[1]。根據(jù)氨基酸的組成和結(jié)構(gòu),常見鵝膏肽類毒素分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘肽三大類。鵝膏毒肽為雙環(huán)八肽,主要包括α-鵝膏毒肽(α-amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin)和γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin);鬼筆毒肽為雙環(huán)七肽,主要包括羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin)和二羥鬼筆毒肽(phalloidin);毒傘素為單環(huán)七肽,致命性相對較弱,相關(guān)研究較少[2]。鵝膏肽類毒素具有強烈的肝毒性,其中鵝膏毒肽的口服半數(shù)致死劑量(LD50)可達0.1 mg/kg,單個毒蘑菇中亦可能含有該毒素劑量;鬼筆毒肽是一種速效毒素,能專一性地與細胞中的肌絲蛋白結(jié)合,進而打破肌絲蛋白與肌球蛋白之間聚合和解聚的動態(tài)平衡,動物靜脈或腹腔注射實驗,2～5 h內(nèi)死亡[3]。

鵝膏肽類毒素引起的蘑菇中毒往往有一定的潛伏期,一般為6～24 h,在極端情況下最長可達36 h,然后才出現(xiàn)臨床中毒癥狀[4]。有研究表明毒蘑菇攝取后約30 h內(nèi)血清中可檢測到鵝膏毒肽;攝取后約72 h內(nèi)尿液中可檢測到鵝膏毒肽[5]。因此,與血液樣本相比,尿液樣本更適合用于鵝膏類蘑菇毒素中毒事件檢測。有文獻報道最早在毒蘑菇攝入后90 min就發(fā)現(xiàn)尿液中存在毒素[6]。盡管鵝膏肽類毒素在毒蘑菇中濃度很高,但生物樣品中相關(guān)毒素的檢出濃度非常低,在μg/L甚至更低水平[3,7]。因此,開發(fā)建立一種高靈敏度、快速定量檢測尿液中鵝膏肽類毒素的方法也顯得十分必要。

目前,關(guān)于尿液中鵝膏肽類毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、高效液相色譜法[6,9]、毛細管電泳法[10]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3,5,11-15]。酶聯(lián)免疫法是一種快速篩選方法;液相色譜、毛細管電泳配合紫外或二極管陣列檢測器存在檢測靈敏度相對較低的問題;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前的主流方法,具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)勢。當前關(guān)于生物樣品中鵝膏肽類毒素殘留檢測的前處理手段主要有蛋白質(zhì)沉淀[11]、固相萃取[3,5,12-14]、免疫親和提取法[15]等。常規(guī)固相萃取小柱凈化法存在溶劑消耗量大、使用成本高等缺陷;蛋白質(zhì)沉淀法存在凈化效果差等缺陷,這些前處理方法均在離線狀態(tài)下進行,費時費力。與傳統(tǒng)的凈化方法相比,TurboFlow (TF)在線凈化通過擴散溶解、尺寸排阻等技術(shù)將蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)過濾掉,保留目標小分子化合物;并通過與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用大大簡化樣品前處理過程,實現(xiàn)在線凈化功能的同時,也保證了檢測方法的靈敏度[16,17]。目前該技術(shù)已應(yīng)用于尿液中β-激動劑[18]、全氟化合物[19]、多環(huán)芳烴代謝物[20]、紫外線吸收劑[21]等典型污染物的檢測。Helfer等[13]首先利用TF在線凈化技術(shù),開展尿液中鵝膏毒肽類的檢測,但該研究采用兩根TurboFlow柱串聯(lián)凈化,增加了使用成本,且未涉及鬼筆毒肽的檢測。徐小民等[22]采用在線ODS微柱結(jié)合單六通閥切換技術(shù),實現(xiàn)了尿液中痕量α-鵝膏毒肽的檢測,也未涉及鬼筆毒肽的檢測。魏佳會等[3]報道毒蘑菇中毒病人尿液樣本中存在鬼筆毒肽類毒素。

本研究利用TF-LC-MS/MS系統(tǒng),建立了直接進樣快速測定尿液中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽的檢測方法。該方法簡便、快速、結(jié)果準確可靠,不需要復(fù)雜前處理,可用于中毒病人尿液的快速定性定量分析,為判定公共衛(wèi)生中毒事件原因和臨床準確識別毒蘑菇中毒提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Transcend Ⅱ在線凈化-液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo公司); TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo公司); Microfuge 20R型微量高速冷凍離心機(美國Beckman公司); Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(德國Merck公司)。

甲酸(LC-MS級)、乙酸銨(色譜純)、乙腈(色譜純)購自德國CNW公司;超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽標準品購自美國Alexis公司,標準純度≥90%。尿液由健康志愿者提供。

1.2 樣品制備

取充分混合后的尿樣1 mL于2 mL聚丙烯離心管中,在4 ℃條件下,以15 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取適量上清液于進樣瓶中。

1.3 標準溶液的配制

鵝膏肽類毒素標準溶液用甲醇溶液稀釋,配成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的標準儲備液。用0.1%(v/v, 下同)甲酸水溶液配制成1、2、5、10、20和50 μg/L的純?nèi)軇藴氏盗?用空白尿液基質(zhì)配制成為1、2、5、10、20和50 μg/L的尿液基質(zhì)標準系列。

1.4 TF凈化及色譜分離條件

富集凈化柱:TurboFlowTMCyclone色譜柱(50 mm×0.5 mm, 60 μm),上樣泵的流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,流動相C為水,流動相D為乙腈,進樣量為50 μL,在線凈化梯度洗脫程序見表1(Loading pump), TF連接圖見圖1。

圖 1 在線凈化流路連接示意圖Fig. 1 Schematic diagram of flow route in the online clean-up modeTF: TurboFlow online clean-up.

分析柱:Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm,美國Thermo公司),流動相A為4 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫見表1(Eluting pump)。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子掃描方式,選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓為3.0 kV;汽化溫度300 ℃;離子傳輸毛細管溫度為325 ℃;鞘氣壓(sheath units)為45 arb,輔助氣壓(arbitrary units)為15 arb,這兩種霧化氣均為高純氮氣,碰撞氣為高純氬氣,壓力為0.2 Pa(1.5 mTorr)。使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。5種鵝膏肽類毒素的檢測參數(shù)見表2。

表 2 鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜檢測參數(shù)

表 1 在線凈化與色譜分離梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

國內(nèi)外很多文獻已證實反相色譜柱適合鵝膏肽類毒素的分離與檢測[3,5,14,15]。本實驗采用由4 mmol/L乙酸銨與甲醇組成的流動相體系,比較了Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)兩根小粒徑反相色譜柱對目標物的色譜分離效果的影響。結(jié)果顯示,兩根C18柱均能較好地實現(xiàn)5種毒素的分離,但是Hypersil GOLD C18產(chǎn)生的系統(tǒng)壓力明顯低于Acquity UPLC BEH C18。因此本研究采用Hypersil GOLD C18柱分離待測組分,能較好地實現(xiàn)目標分析物的色譜分離,見圖2。

圖 2 標準溶液、空白尿樣及加標尿樣中5種鵝膏肽類毒素的SRM色譜圖Fig. 2 SRM chromatograms of the five amanita peptide toxins in a standard solution, a blank urine sample and a spiked urine sample

實驗中分別取1.0 mg/L鵝膏肽類毒素標準溶液,以流動注射方式在電噴霧正離子模式下優(yōu)化目標毒素的質(zhì)譜參數(shù),選擇干擾小、信噪比大的離子對作為定性或定量離子對。優(yōu)化后的透鏡電壓、碰撞能量,選擇的定性和定量離子見表2。鑒于目標毒素的定量、定性子離子質(zhì)量數(shù)較小(見表2),本研究考察了空白尿樣對目標物定量、定性離子通道的影響。從圖2b可見,所選的定量、定性離子通道在目標物出峰時間附近未見明顯色譜峰干擾,各離子通道本底基線也相對較低。

2.2 在線凈化條件優(yōu)化

TF在線凈化程序一般包括上樣與凈化、洗脫、LC分離、色譜柱淋洗與再生等步驟。需要對TF凈化柱、上樣溶劑、洗脫溶劑、轉(zhuǎn)移流速和轉(zhuǎn)移時間等參數(shù)進行優(yōu)化。

2.2.1TF凈化柱的選擇

為了選擇最佳的在線TF凈化柱,考察了3種具有不同化學(xué)修飾基團的TF凈化柱。本研究選擇了兩種聚合物級的TF凈化柱Cyclone(50 mm×0.5 mm)和Cyclone-P(50 mm×0.5 mm)和一種硅膠基TF凈化柱XL-C18(50 mm×0.5 mm)。在最佳液相色譜條件下,將5種毒素混合標準溶液注入TF凈化柱中,比較目標物在色譜柱上的保留能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cyclone柱對5種目標毒素的保留效果最好。TF凈化柱可重復(fù)使用,實際進樣100針后目標物的色譜峰響應(yīng)未見明顯降低。

2.2.2上樣溶劑的選擇

上樣溶劑的組成會影響目標毒素在TF凈化柱上的保留能力。本研究比較了0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸與甲醇組成的不同比例混合溶液作為上樣溶液對目標毒素的色譜峰強度的影響。從圖3a中可見,盡管上樣液中含有機溶劑有助于從樣品中去除不需要的雜質(zhì),但隨著上樣溶液中有機相甲醇含量的不斷增加,目標毒素的色譜峰強度隨之不斷下降,這表明有機相甲醇的存在,降低了目標毒素在TF柱的保留,因此本研究采用0.1%甲酸水溶液作為上樣溶液。

圖 3 在線凈化條件對目標物色譜峰響應(yīng)的影響(n=3)Fig. 3 Effect of online purification conditions on peak intensities of amanita peptide toxins (n=3) a. loading solution; b. eluting solution; c. transfer flow; d. transfer time.

2.2.3洗脫溶劑的選擇

高有機強度洗脫溶劑可在TF凈化柱上獲得令人滿意的分析物回收率,但在分析柱上無法產(chǎn)生尖銳的色譜峰。因此,對洗脫溶劑進行了優(yōu)化,以同時實現(xiàn)目標物的定量洗脫和所需的峰銳度。本研究考察了乙腈和0.1%甲酸組成的不同比例混合物作為洗脫溶劑對目標毒素色譜峰強度的影響。由圖3b可見,當乙腈的比例從5%變?yōu)?0%時,5種目標毒素的回收率隨乙腈比例的上升而升高。當洗脫溶劑中乙腈比例超過20%時,目標毒素的回收率未見明顯升高。研究結(jié)果表明20%的乙腈足以完全將目標物從TF凈化柱上洗脫下來,且目標毒素色譜峰形尖銳對稱。因此,選擇乙腈-0.1%甲酸(20∶80, v/v)作為洗脫溶劑。

2.2.4轉(zhuǎn)移流速的選擇

轉(zhuǎn)移步驟就是將分析物從TF柱轉(zhuǎn)移洗脫到分析柱。較低的轉(zhuǎn)移洗脫流速可能導(dǎo)致峰展寬和保留時間更長。較高的轉(zhuǎn)移流速可加快分析物的轉(zhuǎn)移,但可能會增加色譜柱的壓力。在優(yōu)化實驗中,在轉(zhuǎn)移時間為60 s的條件下,比較了轉(zhuǎn)移流速0.06、0.08、0.10、0.12和0.14 mL/min對5種目標毒素峰強度的影響。從圖3c可見,當傳輸流速為0.06 mL/min,目標毒素色譜峰強度非常小,這表明目標物轉(zhuǎn)移不完全,部分目標物仍保留在TF凈化柱。隨著轉(zhuǎn)移流速的不斷增加,峰面積也隨之增加,當轉(zhuǎn)移流速到達0.10 mL/min后,目標物的峰強度未出現(xiàn)顯著增加。這表明當轉(zhuǎn)移流速到達0.10 mL/min時,目標物已完全從TF柱轉(zhuǎn)移至分析柱。因此,最優(yōu)轉(zhuǎn)移流速設(shè)定為0.10 mL/min。

2.2.5轉(zhuǎn)移時間的選擇

轉(zhuǎn)移時間和轉(zhuǎn)移流速都決定了目標物的洗脫完全與否。本研究在0.10 mL/min的轉(zhuǎn)移流速下,測試了30、60、90和120 s的轉(zhuǎn)移時間對目標毒素的色譜峰響應(yīng)的影響。如圖3d所示,轉(zhuǎn)移時間為30 s時,5種鵝膏肽類毒素的色譜峰強度均很小,這表明目標物轉(zhuǎn)移不完全。當轉(zhuǎn)移時間為60 s時,鵝膏肽類毒素轉(zhuǎn)移到分析柱的比例已超過90%,且色譜峰形良好。當轉(zhuǎn)移時間增加為90或120 s時,目標毒素的峰強度雖略有提高,但是更長的轉(zhuǎn)移時間將導(dǎo)致更長的分析時間,且更多雜質(zhì)將隨目標毒素一起洗脫出來。因此,本研究選擇60 s為最佳轉(zhuǎn)移時間。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評估

本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線的斜率與純?nèi)軇藴是€斜率的百分比來評價檢測方法基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)。評價可按(基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率-1)×100%公式進行。低于100%表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),高于100%表示存在基質(zhì)增強效應(yīng),絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強,如恰好為100%則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。從表3可知,鵝膏類毒素在尿液基質(zhì)中均呈現(xiàn)一定的基質(zhì)抑制作用,基質(zhì)效應(yīng)在-31.6%～-52.7%之間,采用基質(zhì)匹配標準曲線測定實際樣品,可在一定程度上彌補基質(zhì)效應(yīng)對目標毒素定量檢測的影響。

2.4 標準曲線及檢出限

按1.3節(jié)方法配制標準溶液并測定,以鵝膏肽類毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標,目標物峰面積為縱坐標,繪制基質(zhì)標準曲線,在1.0～50 μg/L濃度范圍,線性相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997。在本實驗條件下,以3倍信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限,10倍信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限,得出尿液基質(zhì)中二羥鬼筆毒肽的方法檢出限和定量限分別為0.15 μg/L和0.5 μg/L,其他鵝膏肽類毒素的檢出限和定量限分別可達到0.3 μg/L和1.0 μg/L。結(jié)果見表3。

2.5 方法的回收率與精密度

本研究以尿液為研究對象,考察檢測方法的回收率和精密度。準確移取空白尿液1.0 mL,設(shè)定3個添加水平2.0、5.0和10.0 μg/L,根據(jù)上述方法進行檢測,每組樣品6個平行,連續(xù)測試3天,測定日內(nèi)、日間回收率以及日內(nèi)、日間相對標準偏差(RSD)。由表4可知,尿液基質(zhì)中鵝膏肽類毒素的日內(nèi)和日間回收率分別為87.0%～108.6%和86.8%～112.7%;日內(nèi)、日間RSD均小于為14.5%,可滿足檢測分析的要求。

表 3 5種鵝膏肽類毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

表 4 方法的回收率和精密度

3 結(jié)論

本方法采用TurboFlow在線凈化,高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測,實現(xiàn)了快速定性定量檢測尿液中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽。本方法檢測靈敏度高、重現(xiàn)性好、不需要復(fù)雜前處理,總運行時間僅為11 min,適用于毒蘑菇中毒事件快速篩查和臨床中毒病因識別。