蔣向輝，肖龍騫

(1 懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化 418008；2 懷化學(xué)院 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418008；3 懷化學(xué)院 湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418008)

黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)為忍冬科忍冬屬植物，主產(chǎn)于中國西南部的云南、貴州和廣西等省[1]，是喀斯特地貌地區(qū)重要的先鋒植物，其花蕾或初開的花在民間被作為金銀花原料使用，2015年版藥典將其歸屬于山銀花一類[2]。黃褐毛忍冬的花中主要含有綠原酸、皂苷類、醇類、酯類和類黃酮等多種化合物[3]，其花蕾被廣泛用于治療關(guān)節(jié)炎、感冒、腸炎、發(fā)熱、感染、疼痛和潰瘍等疾病，特別是其中的類黃酮具有同時可以抑制HIV蛋白酶和HIV整合酶的雙重抑制活性[4]，有望開發(fā)出治療抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的先導(dǎo)化合物。中國喀斯特土壤肥力低、偏堿性和鈣元素含量高[5]，生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力低，在這一特定地理?xiàng)l件下孕育的黃褐毛忍冬具有耐礦質(zhì)元素脅迫、耐旱和耐貧瘠等特有的生理代謝機(jī)制，進(jìn)行黃褐毛忍冬響應(yīng)非生物脅迫逆境生理機(jī)制的研究，對于中國西部地區(qū)喀斯特地貌的修復(fù)和特色藥用植物的開發(fā)利用有十分重要的意義。

硼(B)是植物必需的一種獨(dú)特的非金屬微量元素，植物整個生命周期一直需要B?？λ固赝寥乐械腂主要以硼酸的形式存在，由于硼酸的高溶解性而易于被降雨溶出，所以喀斯特土壤中B元素含量較低。中國西南部、印度西北部、尼泊爾、日本、孟加拉國和巴西等地區(qū)是缺B危害最大的地區(qū)。但土壤中B缺乏和過量之間的范圍很窄[6]，Sun等[7]認(rèn)為0.5～2.0 mg/kg是植物所需要的土壤中B含量的最佳范圍，土壤中較低或較高的B含量將導(dǎo)致植物表現(xiàn)B缺乏或B過量脅迫，在不需要B的土壤中施加高比例的B將會導(dǎo)致植物發(fā)生B毒性而降低產(chǎn)量。植物非生物逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，包括MYB、bHLH和WDR等轉(zhuǎn)錄因子[8]。植物中大多數(shù)MYB蛋白屬于R2R3-MYB亞家族，已有研究表明該亞家族的成員參與植物干旱和鹽脅迫等非生物脅迫的基因表達(dá)調(diào)控[9]。

本研究在喀斯特土壤中對黃褐毛忍冬進(jìn)行不同濃度的施加B肥處理，監(jiān)測黃褐毛忍冬不同部位B元素含量變化及LfMYB表達(dá)量變化，研究黃褐毛忍冬LfMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量與B濃度之間的關(guān)系，解析黃褐毛忍冬響應(yīng)非生物脅迫逆境的生理機(jī)制，為中國西部地區(qū)喀斯特地貌的修復(fù)和特色藥用植物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)中的黃褐毛忍冬采自貴州省興義市安龍鎮(zhèn)，經(jīng)湖南省林業(yè)科學(xué)研究院王旭軍研究員鑒定為忍冬屬植物黃褐毛忍冬。

1.2 方 法

1.2.1 黃褐毛忍冬不同土壤栽培處理收集喀斯特土壤表層20 cm處的土壤，置80 ℃烘箱2 d烘干，過8 mm篩后，將此基質(zhì)分成兩份，一份直接用于栽培黃褐毛忍冬，另一份加1/3重量的腐化牛糞后再用于栽培黃褐毛忍冬，于開花期收集不同栽培條件下的黃褐毛忍冬頂端幼葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異分析，篩選表達(dá)量差異顯著(P<0.05)的MYB基因序列。于開花前一個月開始，對喀斯特土壤基質(zhì)下栽培的黃褐毛忍冬進(jìn)行0.25、1.0 和2.5 mg/L不同濃度B的葉面噴施處理，每株噴施300 mL溶液，隔10 d噴1次，3次噴完。采用 ICP 等離子體原子發(fā)射光譜儀(Agilent 7500CE)測定土壤硼(B)元素含量。

1.2.2LfMYB全長CDS克隆與生物信息學(xué)分析分別采集喀斯特土壤基質(zhì)和加牛糞基質(zhì)下種植的黃褐毛忍冬頂端幼葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異分析，獲得差異表達(dá)的MYB片段序列，采用RACE克隆的方法克隆MYB全長CDS序列。通過https://www.expasy.org/proteomics網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，通過https://prosite.expasy.org網(wǎng)站進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。通過http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw網(wǎng)站進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。

1.2.3LfMYB原核表達(dá)活性分析構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-LfMYB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，采用不同濃度的IPTG進(jìn)行BL21誘導(dǎo)培養(yǎng)，充分收取菌液，經(jīng)超聲破碎后吸上清，采用鎳柱純化法獲得重組蛋白，對融合蛋白采用考馬斯亮蘭染色的方法進(jìn)行檢測。

1.2.4 LfMYB轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證參照Wang等[10]方法進(jìn)行LfMYB反式轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)錄因子LfMYB的全長CDS克隆進(jìn)pGBKT7載體得到 pBD-LfMYB質(zhì)粒，同時分別以pBD 為陰性載體、pGAL4為陽性載體，采用乙酰酸鋰介導(dǎo)的方法將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌YGR-2細(xì)胞，涂布于營養(yǎng)缺失的培養(yǎng)基(SD/-Trp)培養(yǎng)2 d，然后將陽性克隆轉(zhuǎn)移到加有10 mmol/L 3-AT的SD/-Trp-His-Ade平板上生長，在30 ℃下培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計生長情況，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄因子的激活活性。

1.2.5LfMYB表達(dá)量檢測與B含量檢測采用Invitrogen公司的TRizol 試劑盒分別提取不同濃度B處理后的黃褐毛忍冬不同器官總RNA，參照楊總應(yīng)等方法[11]逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測，以actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物為actin-F(5′-ATGATGCTCCCAGGGCAGTTT-3′)和actin-R(5′-TCCATGTCATCCCAGTTGCTG-3′)。LfMYB基因表達(dá)的定量PCR引物為LfMYB-Q-F (5′-CTGACTTAAAGAGCGGCAATA-3′)和LfMYB-Q-R(5′-GGAAGCGGTGGTTTAGTTT-3′)。應(yīng)用比較Ct值法測定LfMYB相對表達(dá)量。參照蔣向輝等[12]采用原子吸收光譜儀法測定相應(yīng)器官中B含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LfMYB 全長CDS克隆與生物信息學(xué)分析

對不同栽培條件下的黃褐毛忍冬頂端幼葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，使用Trinity軟件拼接得到78個MYB基因相關(guān)的重疊群(contigs)，從中篩選出一個460 bp的差異表達(dá)片段，采用RACE克隆的方法成功獲得了黃褐毛忍冬MYB全長CDS序列(將其命名為LfMYB)，LfMYB編碼序列為1 005 bp(圖1)，可編碼334個氨基酸殘基，GenBank登錄號為MT424590。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，LfMYB與忍冬屬其他MYB成員聚集成一個進(jìn)化枝(圖2)。LfMYB蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)分別為37.92 kD和5.05。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，LfMYB編碼序列與LjaMYB12序列相似度為97.6%(圖3)，在氨基末端有3個MYB重復(fù)。與NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的多個MYB轉(zhuǎn)錄因子序列比對顯示，LfMYB具有與MYB亞組R2R3轉(zhuǎn)錄因子相同的保守的R2R3結(jié)構(gòu)域。經(jīng)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，LfMYB有 9 個氨基酸位點(diǎn)可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化，其中 5 個位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)內(nèi)。

1.M. DL5000；1～3分別為5′-RACE第一輪PCR產(chǎn)物、第二輪PCR產(chǎn)物和第二輪PCR空白對照；B. 4～6分別為3′-RACE第一輪PCR產(chǎn)物、第二輪PCR產(chǎn)物和第二輪PCR空白對照圖1 LfMYB基因5′-RACE(A)和3′-RACE(B) PCR產(chǎn)物電泳檢測M. DL5000；A. 1-3 5′-RACE first round PCR products, second round PCR products and second round blank control; B. 4-6 3′-RACE first round PCR products, second round PCR products and second round blank controlFig.1 5′-RACE(A) and 3′-RACE(B) PCR products of LfMYB checked by electrophoresis

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的不同物種LfMYB基因聚類樹Fig.2 Phylogenetic clustering of LfMYB in different species based on Neighbor Joining method

2.2 LfMYB原核表達(dá)活性分析

利用大腸桿菌BL21對LfMYB所編碼蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后，通過鎳柱純化的方法得到了可溶性重組蛋白，融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示pCOLD-LfMYB重組蛋白經(jīng)0.2、0.4和0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后都能表達(dá)，蛋白大小為75 kD左右(圖4)，而Pcold TF空載未見有相應(yīng)大小的蛋白表達(dá)，大腸桿菌 BL21空菌經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后也未見有相應(yīng)大小的蛋白表達(dá)。

2.3 LfMYB轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證

LfMYB轉(zhuǎn)錄活性檢測結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBD-LfMYB、pGAL4(陽性對照)和pBD(陰性對照)的酵母在SD/-Trp+3AT培養(yǎng)基上均能生長，但在SD/-Trp-His-Ade+3AT的平板僅轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pBD-LfMYB和pGAL4的酵母能生長，而轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBD的酵母不能生長(圖5)，這表明 LfMYB在酵母中能夠正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，且能夠激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，這表明LfMYB有自激活活性。

圖3 LfMYB與LjaMYB12基因序列相似性比較Fig.3 Comparison of sequence similarity between LfMYB and LjaMYB12

2.4 LfMYB表達(dá)量與B含量檢測

喀斯特土壤基質(zhì)中B元素的含量為0.962 mg/kg，含量低于Muran等[13]認(rèn)為的能引起植物B脅迫的水平臨界值2.0 mg/kg。黃褐毛忍冬經(jīng)不同濃度B處理后對不同部位LfMYB進(jìn)行qRT-PCR檢測結(jié)果如表1，結(jié)果表明LfMYB在老葉、白花和黃花中表達(dá)量明顯高于其他部位，而幼莖和幼葉中表達(dá)量相對較低。在喀斯特土壤基質(zhì)中添加中濃度B導(dǎo)致黃褐毛忍冬不同部位LfMYB表達(dá)量均有提高，其中以老葉、白花和黃花提高最明顯(P<0.05)，但當(dāng)施加高濃度B(2.5 mg/L)時，各部位LfMYB表達(dá)量均明顯降低，而以幼葉、幼莖和綠蕾降低最為明顯(P<0.05)。黃褐毛忍冬經(jīng)不同濃度B處理后，檢測不同部位B含量結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示B主要積累在黃褐毛忍冬的老葉和莖中，且隨著施加B濃度升高，黃褐毛忍冬的各部位B含量隨之升高，其中以幼葉、老葉和幼莖中B含量升高最為明顯(P<0.05)。綜上所述，在喀斯特土壤基質(zhì)中施加一定濃度范圍的B元素時，隨著B元素濃度增加，黃褐毛忍冬各部位LfMYB表達(dá)量隨之增加；當(dāng)施加B元素達(dá)到中濃度(1.0 mg/L)時，LfMYB在老葉、白花和黃花中表達(dá)量增加更明顯；但是，隨著B元素濃度的繼續(xù)增加，黃褐毛忍冬各部位LfMYB表達(dá)量反而減少，其中在幼葉、幼莖和綠蕾中LfMYB表達(dá)量降低達(dá)到顯著水平。

1. 空白對照；2. 陽性對照；3～ 5表分別表示經(jīng)0.2、0.4和0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的重組蛋白；6～ 8分別表示經(jīng)0.2、0.4和0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的Pcold TF蛋白(空載)；9～ 11分別表示經(jīng)0.2、0.4和0.8 mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的E.coli BL21(空菌)圖4 LfMYB原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測1. Blank control; 2. Positive control; 3-5. Recombinant protein (induction by IPTG of 0.2, 0.4, and 0.8 mmol/L, respectively); 6-8. Pcold TF protein (no load) induced by IPTG of 0.2, 0.4 and 0.8 mmol/L, respectively; 9-11. E. coli BL21 (empty bacteria) induced by IPTG of 0.2, 0.4 and 0.8 mmol/L, respectively)Fig.4 SDS-PAGE detection of LfMYB prokaryotic expression product

圖5 pBD-LfMYB自激活活性分析Fig.5 pBD-LfMYB autonomous activation analysis

表1 施加不同濃度B元素對黃褐毛忍冬各器官LfMYB表達(dá)量的影響

同類型器官不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)圖6 不同濃度B處理后黃褐毛忍冬不同器官中B元素含量Different normal letters in the same organ indicate significant difference at 0. 05 levelFig.6 B element content in different organs of L. fulvotomentosa treated by different concentrations of B

3 討 論

本研究從黃褐毛忍冬中分離出了一個編碼基因LfMYB，系統(tǒng)發(fā)育分析和保守序列分析表明LfMYB屬于MYB，反式激活分析表明LfMYB是轉(zhuǎn)錄激活因子，LfMYB基因序列與LjaMYB12序列相似度為97.6%。Qi等[9]研究表明LjaMYB12的轉(zhuǎn)錄水平與金銀花發(fā)育過程中的總黃酮含量成正比，認(rèn)為LjaMYB12是植物中的黃酮醇特異性調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示，黃褐毛忍冬LfMYB在老葉、白花和黃花表達(dá)量明顯高于其他部位。黃褐毛忍冬是忍冬科中最重要的變種之一，它具有與金銀花相似的化學(xué)組成和藥理作用[14]。雖然，LfMYB基因序列與LjaMYB12序列相似度極高，但轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中作用的靶基因具有明顯的特異性，Nakatsuka等[15]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子GtMYBP3在擬南芥中過表達(dá)可以增加黃酮醇的積累，而在煙草中過表達(dá)時卻未觀察到黃酮醇含量的明顯變化。LUO等[16]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AtMYB12在番茄中異源表達(dá)時，可以調(diào)控PAL、CHS和GT基因表達(dá)量呈現(xiàn)超過100倍的增加，C4H、4CL和HQT基因表達(dá)量呈現(xiàn)出3～10倍的增加。ZHAO等[17]研究發(fā)現(xiàn)LjaMYB12在擬南芥中過表達(dá)能促進(jìn)PAL、F3H、FNS、CHS和CHI等黃酮生物合成基因的表達(dá)上調(diào)。STRACKE等[18]研究認(rèn)為，同一亞組的轉(zhuǎn)錄因子通常表現(xiàn)出相似的調(diào)節(jié)功能，但LfMYB與LjaMYB12是否屬于同一亞組，這還有待進(jìn)一步確認(rèn)。因此，LfMYB在白花和黃花中的特異性表達(dá)對下游基因的調(diào)控特性是否與LjaMYB12相似，是否與其黃酮類藥用成分的合成緊密相關(guān)，這還有待對黃褐毛忍冬中黃酮類藥用成分合成相關(guān)基因的定量PCR檢測與黃酮類成分的含量測定。

本研究結(jié)果顯示在喀斯特土壤基質(zhì)中施加一定量的B元素可促進(jìn)LfMYB的表達(dá)量增加，而過量的B元素則抑制LfMYB的表達(dá)，這種抑制作用在幼葉、幼莖和綠蕾中最顯著，這在另一個方面進(jìn)一步證實(shí)了Gupta等[19]提出的B元素主要參與植物細(xì)胞分裂、開花和座果等代謝活動的觀點(diǎn)。

Li等[20]研究認(rèn)為B對類黃酮等成分合成影響極為明顯。本研究結(jié)果顯示，黃褐毛忍冬在B脅迫的條件下，過量的B主要積累在老葉、白花和黃花中，而白花和黃花是黃褐毛忍冬的主要藥用部位。并且，另有研究表明，植物的生殖生長對硼缺乏的反應(yīng)比營養(yǎng)生長更敏感，直接影響植物的開花與座果，特別是對類黃酮的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響極為明顯[18]。因此，對喀斯特高鈣、缺硼生境下的黃褐毛忍冬合理追施B肥，這是提高黃褐毛忍冬藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量的有效措施。已有研究表明在植物中Ca或B的缺乏或過量會影響另一種元素的營養(yǎng)狀況[21]，因此，研究喀斯特高鈣生境下黃褐毛忍冬對B吸收利用的分子機(jī)理，將為黃褐毛忍冬施加B肥的栽培措施提供很好的參考。

忍冬屬藥用植物中含有黃芩素、槲皮素、蘆丁、二羥黃酮、山柰酚、槲皮素和楊梅素等多種類黃酮化合物[20]。類黃酮化合物含量是評估忍冬屬植物藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。近年來在忍冬屬藥用植物中有關(guān)黃酮醇、黃烷醇和花色苷等類黃酮化合物生物合成途徑的研究越來越多，類黃酮生物合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受生物與非生物因素協(xié)同作用[22]。植物中大多數(shù)MYB蛋白屬于R2R3-MYB亞家族，已有研究表明該亞家族的成員參與干旱和鹽脅迫等非生物脅迫的調(diào)控[9]。本研究結(jié)果顯示，LfMYB是屬于R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄激活因子，對其進(jìn)行B脅迫下類黃酮代謝調(diào)控機(jī)理研究，將為黃褐毛忍冬礦質(zhì)營養(yǎng)的改良和類黃酮代謝調(diào)控奠定重要的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。