孔 蘭，樊榮輝，林榕燕，葉秀仙，林 兵，鐘淮欽*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所, 福州 350013; 2 福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心, 福州 350013)

花色、花香作為觀賞植物重要的表型性狀，決定了蘭花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。雜交蘭(Cymbidiumhybrid)是蘭屬中的國(guó)蘭和大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)雜交培育而成的一類蘭花的特稱，繼承了國(guó)蘭的幽香和大花蕙蘭花大、色艷、花箭出架等優(yōu)異特性，植株適中，花期長(zhǎng)，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3-5]。此外，雜交蘭花色和花香多樣，也是研究花色和花香形成機(jī)制的理想材料[6-7]。

目前，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了觀賞型植物花色素和香氣成分分析[8-9]。不同花色雜交蘭色素成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，花青素決定了雜交蘭紅色素和紫色色素的積累，而類胡蘿卜素影響了黃色色素的積累[10-11]。陳藝荃等[12]應(yīng)用頂空-固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了7個(gè)雜交蘭品種的花香成分，發(fā)現(xiàn)萜烯類化合物是其主要花香成分，不同品種間花香成分存在顯著差異。上述研究表明，雜交蘭不同品種的花色素和花香成分生物合成存在異同。

前人基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了蝴蝶蘭[13]、文心蘭[14]、卡特蘭[15]、春蘭[16]和建蘭[17]等蘭科植物花色素和花香成分生物合成的主要功能基因及其差異表達(dá)，建立了花色花香形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但對(duì)雜交蘭特定的花色和花香、相關(guān)分子機(jī)制仍待研究。

雜交蘭K18為黃色花，其花香成分包括石竹烯、α-香柑油烯、反式橙花叔醇、β-姜黃烯和β-羅勒烯等化合物，主成分為倍半萜；K24的花為紫紅色，其花香成分包括桉油精、正己醇和反式法呢醛等化合物，主成分為單萜[12]。因此，本研究以K18和K24為材料，采用RNA-Seq技術(shù)獲得雜交蘭不同花期的花朵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析雜交蘭不同花色/花香相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控變化，為深入研究其分子機(jī)制以及蘭花品種改良提供有效信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

黃花清香型K18(‘玉鳳’)為本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)品種，紫紅花淡香型K24(‘福韻丹霞’)是本實(shí)驗(yàn)室大花蕙蘭和墨蘭雜交而來(lái)的自育品種，均種植于福建省農(nóng)科院作物所花卉研究室苗圃中。分別采集K18和K24小花蕾期、半開(kāi)期和盛花期的花朵(圖1)，-80 ℃冷凍保存，用于后續(xù)RNA-seq分析。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及測(cè)序使用TaKaRa植物RNA提取試劑盒(Cat#9769)提取雜交蘭不同花期的總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解和污染；分別使用NanoPhotometer分光光度計(jì)、Qubit?2.0熒光計(jì)和Agilent bioanalyzer 2100系統(tǒng)檢測(cè)RNA純度、濃度和RNA完整性；根據(jù)NEB-Next?UltraTMRNA文庫(kù)制備試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)構(gòu)建18個(gè)不同花期樣品(含3個(gè)生物學(xué)重復(fù))的測(cè)序文庫(kù)，并利用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，生成兩端測(cè)序Reads。測(cè)序工作由北京諾禾致源生物公司完成。

A～ C. K18小花蕾期、半開(kāi)期和盛花期；D～ F. K24小花蕾期、半開(kāi)期和盛花期圖1 K18 和 K24 不同花期表型A-C. Bud stage, half flowering stage and flowering stage in K18；D-F. Bud stage, half flowering stage and flowering stage in K24Fig.1 Phenotypes of K18 and K24 at different flowering stages

1.2.2 功能注釋和表達(dá)差異分析采用Trinity[18]軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組Clean reads進(jìn)行拼接獲得轉(zhuǎn)錄本序列。根據(jù)序列相似性，比對(duì)到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、GO(e<1e-5)、Pfam(e<0.01)和COG(e<0.001)七大數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得相應(yīng)基因的功能注釋?；贜r和Pfam獲得的蛋白功能注釋結(jié)果，利用KAAS[19]軟件對(duì)基因進(jìn)行KO注釋，完成KEGG代謝通路分類。采用DESeq R[20]軟件包分析不同花發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因，并通過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。readcount數(shù)值為基因差異表達(dá)的分析數(shù)據(jù)，校正后的P<0.05且|log2(foldchange)|>1設(shè)置為基因顯著差異表達(dá)的篩選閾值。使用KOBAS[21]軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析，校正后P<0.05的Pathway為顯著富集的代謝通路。

1.2.3 qRT-PCR驗(yàn)證以雜交蘭小花蕾、半開(kāi)期和盛花期花朵的總RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eeaser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)，以cDNA為模板，在ABI7500 PCR儀上完成qRT-PCR。用2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。Actin為內(nèi)參基因。

1.2.4 花色素苷成分檢測(cè)參照徐怡倩等[22]的方法，應(yīng)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-QTOF-MS)檢測(cè)雜交蘭花色素苷成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝與功能注釋

K18和K24樣品測(cè)序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和處理，獲得446.52 M有效數(shù)據(jù)，共66.97 Gb，Q30在92.00%以上，GC含量均大于46.11%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。有效數(shù)據(jù)組裝后獲得787 529和336 170條轉(zhuǎn)錄本(transcript)和單基因(unigene)；其中unigene平均長(zhǎng)度為599 bp，N50長(zhǎng)度為868 bp，組裝完整性較高，可用于后續(xù)分析。通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，36.13% unigene獲得功能注釋(表1)。其中，Nr數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的unigene數(shù)目最多，為86 272個(gè)(25.66%)；GO數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到50 174個(gè)unigene(14.92%)；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到18 789個(gè)unigene(5.58%)注釋。

2.2 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析及KEGG功能分類

對(duì)K18和K24不同花期的差異表達(dá)基因(differently expressed gene，DEG)比較結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，K18中，較盛花期分別有11 914和1 082個(gè)基因在小花蕾期和半開(kāi)期差異表達(dá)；K24中，較盛花期分別有6 793和459個(gè)基因在小花蕾期和半開(kāi)期差異表達(dá)。K18-1 vs K18-3或K24-1 vs K24-3比較組中涵蓋了全部的DEG，且上調(diào)基因數(shù)目明顯低于下調(diào)基因數(shù)目。此外，本研究比較了小花蕾期和盛花

表1 功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖2 雜交蘭不同時(shí)期差異表達(dá)基因的分布Fig.2 Distribution of DEGs among different flower developmental stages

期 K18 與 K24 之間的DEG，其中K18-1 vs K24-1獲得17 920個(gè)DEG，K18-3 vs K24-3獲得13 161個(gè)DEG。

分別對(duì)K18-1 vs K18-3和K24-1 vs K24-3的11 914個(gè)和6 793個(gè)DEG比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中。K18-1 vs K18-3的DEG在淀粉和蔗糖代謝(ko00500，228)富集最顯著，其次是類胡蘿卜素生物合成(ko00906，50)、亞油酸代謝(ko00591，47)和萜類骨架生物合成(ko00900，66)等。K24-1 vs K24-3富集最多的是苯丙烷類生物合成(ko00940，130)、萜類骨架生物合成(ko00900，59)和α-亞麻酸代謝(ko00592，71)等。已明確的是，類胡蘿卜素生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑介導(dǎo)了花色的形成，而萜類骨架生物合成途徑、倍半萜和三萜生物合成途徑與花香直接相關(guān)。

2.3 花色素生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因分析

13個(gè)花色相關(guān)差異表達(dá)基因參與類胡蘿卜素生物合成途徑(表2)。如圖3，A顯示，與小花蕾期相比，K18中八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因(Z-ISO)等的表達(dá)量在盛花期均上調(diào)；番茄紅素環(huán)化酶基因(LYCE和LYCB)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(BCH1)的表達(dá)量下調(diào)。K24盛花期與小花蕾期相比，上調(diào)的基因有PSY、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因(ZEP)和VDE；下調(diào)的基因有PDS、Z-ISO和BCH1等。

表2 花色結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)

A. 類胡蘿卜素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜；B. 類黃酮生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜圖3 K18 和 K24 中花色素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜A. The expression profile of structural genes involved in carotenoid biosynthesis; B. The expression profile of structural genes involved in anthocyanin biosynthesisFig.3 Expression profiles of structural genes associated with pigment biosynthesis in K18 and K24 at three flower developmental stages

A. 倍半萜生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜；B. 單萜生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜圖4 K18 和 K24 中萜類合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)譜A. Expression profile of structural genes involved in sesquiterpene biosynthesis; B. Expression profile of structural genes involved in monoterpene biosynthesisFig.4 Expression profiles of structural genes associated with terpenoid biosynthesis in K18 and K24

16個(gè)差異表達(dá)基因參與類黃酮生物合成途徑(表2)。除類黃酮-3′,5′羥化酶基因(F3′5′H)外，其他類黃酮生物合成關(guān)鍵基因在 K18 和 K24 中均表現(xiàn)相似的表達(dá)模式。其中，查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮3-羥基酶基因(F3H)和黃酮醇合酶基因(FLS)等均表現(xiàn)下調(diào)，查耳酮合酶基因(CHS)和類黃酮-3′羥化酶基因(F3′H)既有上調(diào)表達(dá)也有下調(diào)表達(dá)；F3′5′H在K18的小花蕾期表達(dá)水平最高，在K24的3個(gè)時(shí)期均無(wú)明顯差異表達(dá)(圖3，B)。

2.4 雜交蘭萜類生物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因

28個(gè)花香結(jié)構(gòu)基因參與萜類骨架生物合成途徑，其不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平具有顯著差異(圖4，表3)。甲羥戊酸(MVA)途徑中羥甲基戊二酰輔酶基因(HMGS)、羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(HMGR2)、甲羥戊酸-5-焦磷酸合酶基因(MVD)及異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(IDI)的表達(dá)水平在半開(kāi)期或盛花期顯著上調(diào)，且K18的表達(dá)量明顯高于K24(圖4，A)。2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑中除2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶基因(MCT)和牻牛兒基焦磷酸合酶基因(GPPS)外，其他酶基因在盛花期高表達(dá)，且在K24中優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖4，B)。

表3 花香結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)

此外，本研究篩選到112個(gè)差異表達(dá)的萜烯合酶基因(TPS)，多數(shù)TPS的表達(dá)水平在盛花期最高，與香氣釋放呈正相關(guān)。其中，倍半萜生物合成途徑中DN78169_c2_g2(alpha-humulene synthase-like)、DN99176_c3_g1(Beta-cubebene synthase)、DN80925_c0_g1(germacrene D synthase)和單萜生物合成途徑中DN64363_c2_g4(beta-ocimene synthase)、DN72253_c0_g1(terpene synthase 10-like)和DN83821_c0_g4(linalool synthase)在K18盛花期的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，且高于K24(>100倍)。而單萜合酶基因DN65004_c3_g1、DN87421_c2_g1(alpha-terpineol synthase)和DN78962_c1_g1(terpene synthase 10-like)在K24盛花期的轉(zhuǎn)錄水平高于K18。

2.5 花色素苷成分檢測(cè)

對(duì)雜交蘭K18和K24盛花期花瓣花色素苷進(jìn)行定量定性分析，結(jié)果顯示，共有18種花色素苷，花色素苷總含量存在顯著差異，K24中花色苷含量為608.74 μg·g-1，K18花色苷含量?jī)H為K24的20%。K24花中色素物質(zhì)主要成分為矢車菊素苷，使其花色呈紅色；K18中飛燕草素苷含量相對(duì)較高(表4)。

2.6 花色花香結(jié)構(gòu)基因的qRT-PCR分析

對(duì)16個(gè)花色花香結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，其表達(dá)結(jié)果與RNA-Seq的測(cè)序結(jié)果相似，驗(yàn)證了RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性(圖5)?；ㄉY(jié)構(gòu)基因LYCE、F3H和FLS在小花蕾期表達(dá)量最高，且K18中表達(dá)水平高于K24；ANS則在K24的小花蕾期顯著表達(dá)?；ㄏ憬Y(jié)構(gòu)基因DXS2和TPS1-8在盛花期的表達(dá)水平明顯高于小花蕾期和半開(kāi)期，其中TPS1、TPS2和TPS5-8在K18盛花期中的表達(dá)量約為K24的100倍以上。

表4 K18和K24中花色素苷成分鑒定

K18-1、K24-1. 小花蕾期；K18-2、K24-2. 半開(kāi)期；K18-3、K24-3. 盛花期圖5 雜交蘭花色花香合成相關(guān)基因的表達(dá)情況K18-1， K24-1. Bud; K18-2， K24-2. Half flowering; K18-3， K24-3. Full floweringFig.5 Expression analysis of genes involved in pigment biosynthesis and terpenoid biosynthesis in Cymbidium hybrid

3 討 論

本研究對(duì)2個(gè)雜交蘭品種的不同時(shí)期花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得了336 170個(gè)unigene，其中36.13%的unigene成功注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)?；贙EGG通路富集和表達(dá)譜分析，獲得了58個(gè)花色花香相關(guān)差異表達(dá)基因及其在不同發(fā)育階段花中的表達(dá)豐度(FPKM值)，這些關(guān)鍵差異基因在雜交蘭花色花香形成過(guò)程中具有重要作用。

類胡蘿卜素和類黃酮是植物的兩大呈色物質(zhì)，其生物合成途徑得到了系統(tǒng)的研究[23-25]。其中類黃酮生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、FLS、DFR和ANS已相繼被克隆和功能分析，這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的高表達(dá)可影響色素的積累，進(jìn)而決定從淺黃到紅色或藍(lán)紫色等花色的呈現(xiàn)[26]。前人研究表明[27-29]，ANS的表達(dá)可促進(jìn)紅色花的形成，而F3′5′H和FLS的高表達(dá)可促進(jìn)黃酮醇物質(zhì)的積累，從而使花呈現(xiàn)黃色。本研究發(fā)現(xiàn)類黃酮生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因整體上在小花蕾期表達(dá)量最高，盛花期顯著降低，與文心蘭花色相關(guān)基因的表達(dá)模式相似[14]。然而，CHI、F3′5′H、FLS和ANS的表達(dá)水平在 K18 和 K24 間存在顯著差異(圖3，B)，其中ANS在K24的表達(dá)量明顯較高，可能是K24花瓣中花色苷含量高于K18的原因之一；K18花中雖含有少量飛燕草素和飛燕草3-蕓香糖苷，但其花朵顏色為黃色，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qPCR結(jié)果顯示CHI、F3′5′H和FLS在K18中顯著高表達(dá)，推測(cè)K18通過(guò)CHI、F3′5′H、FLS途徑積累了大量黃酮醇而不是花青素，從而影響了花朵顏色的決定。此外，前期課題組研究發(fā)現(xiàn)K18花中未檢測(cè)出類胡蘿卜素，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示其類胡蘿卜素生物合成途徑除上游結(jié)構(gòu)基因PSY、PDS、ZDS、ctrISO表達(dá)較高外，下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平偏低，這可能是造成類胡蘿卜素合成受阻的原因。

萜烯類化合物是雜交蘭主要的花香物質(zhì)。目前春蘭[16]、臘梅[30]、百合[31]、姜花[32]等花卉中萜類化合物生物合成途徑已研究得較為清楚。Ramya等[16]指出FPPS、HMGS、HMGR和AACT的表達(dá)量與春蘭倍半萜物質(zhì)金合歡醇的合成和釋放呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)K18倍半萜合成途徑的HMGS、HMGR2、MVD、IDI和FPPS的表達(dá)水平均在盛花期最高(圖4，A)，與香氣釋放規(guī)律一致，推測(cè)這些基因的表達(dá)為K18倍半萜物質(zhì)的合成提供上游底物。與K18相比，K24的香氣較弱，而單萜合成途徑的DXR和DXS在K24的表達(dá)量明顯高于K18(圖4，B)，前人研究結(jié)果表明DXR和DXS的表達(dá)促進(jìn)了單萜類物質(zhì)的合成[33-34]，推測(cè)DXR和DXS是K24主要花香成分單萜物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因。此外，本研究中TPS的表達(dá)水平隨花開(kāi)放進(jìn)程總體呈上升趨勢(shì)，且在K18中的表達(dá)量高于K24，解釋了K18比K24香氣更清香的原因。

目前，雖已克隆了較多的花色和花香相關(guān)基因，但這些基因多集中在模式植物中，且它們的分子調(diào)控機(jī)理還有待完善。本研究通過(guò)雜交蘭不同時(shí)期花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘到大量與類黃酮生物合成途徑和萜類生物合成途徑相關(guān)的酶基因，豐富了相關(guān)途徑的基因庫(kù)。在后續(xù)研究中可進(jìn)一步結(jié)合蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)分析驗(yàn)證相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白組水平和代謝組水平的一致性。另外，花青素和花香物質(zhì)的合成由調(diào)節(jié)因子和結(jié)構(gòu)基因共同決定的[32,35-36]，后期可結(jié)合調(diào)控因子對(duì)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)基因分析，闡明雜交蘭花色花香相關(guān)基因的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，為今后雜交蘭花色花香的定向改良和新品種選育提供了可靠依據(jù)。