周 瑞，劉妍如，許洪波，于金高，王 征，張君威，宋忠興，黃 峰，唐志書

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室(培育)，陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西咸陽 712083；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，陜西咸陽 712046)

新型冠狀病毒(2019-nCoV, SARS-CoV-2)與SARS冠狀病毒是同一類，但不是同一種[1]。2020年2月11日世界衛(wèi)生組織(WHO)將其感染所致的疾病命名為新型冠狀病毒肺炎(novel coronavirus disease 2019, COVID-19)。2020年3月11日，WHO將COVID-19確定為全球大流行。目前，全球疫情防控形勢仍十分嚴(yán)峻。經(jīng)過全國范圍內(nèi)的聯(lián)防聯(lián)控措施，我國疫情已基本穩(wěn)定。該病前期主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等；重癥患者出現(xiàn)呼吸困難和低氧血癥；危重癥患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、膿毒癥休克及多器官功能衰竭等[2-4]。臨床主要采用中西醫(yī)結(jié)合對癥治療，取得了很好的治療效果[5-6]。

中醫(yī)認(rèn)為咳嗽緣于外感六淫、內(nèi)傷七情導(dǎo)致肺失宣發(fā)肅降，肺氣上逆，氣機紊亂，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為咳嗽是上呼吸道和肺臟自身炎癥的表現(xiàn)，咳嗽也歸屬于肺系炎癥的范疇，細(xì)菌、病毒感染引起的肺炎是咳嗽最常見的原因[7-8]。止咳枇杷合劑是臨床治療咳嗽的有效方劑，主要針對肺失肅降而設(shè)，方中枇杷葉、白前、桔梗降肺氣止咳為君藥，百部斂肺止咳、桑白皮清熱止咳共為臣藥，佐以薄荷清熱解表開宣肺氣，主藥合用達(dá)到宣肺降氣、斂肺止咳之目的。COVID-19主要臨床表現(xiàn)肺失宣發(fā)肅降病機，推測該方可能通過宣肺止咳，有效阻斷COVID-19病情進(jìn)展。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了生物信息學(xué)和計算機科學(xué)等方法，與分子對接技術(shù)結(jié)合研究中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制[9-12]，能充分體現(xiàn)中藥治療疾病“多成分、多靶點、多途徑”的優(yōu)勢，為實驗提供了強有力的數(shù)據(jù)支撐。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出止咳枇杷合劑的作用靶點，并進(jìn)行聚類分析，預(yù)測其具有抗COVID-19作用的核心活性化合物，進(jìn)而運用分析軟件對中藥-化合物-靶點進(jìn)行信號通路分析，預(yù)測其治療COVID-19的作用機制，并通過分子對接篩選枇杷合劑中核心抗病毒化學(xué)成分，為止咳枇杷合劑用于治療COVID-19提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 止咳枇杷合劑干預(yù)COVID-19的可行性

1.1.1化學(xué)成分的收集及篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/)數(shù)據(jù)庫檢索，以止咳枇杷合劑組方中藥“枇杷葉”、“桑白皮”、“白前”、“百部”、“桔?！?、“薄荷腦”為關(guān)鍵詞檢索，收集組方中藥的主要化學(xué)成分。進(jìn)一步以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%或類藥性(drug likeness, DL)≥ 0.18作為條件，對化合物進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

1.1.2“化合物-疾病靶點”篩選及“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCMSP、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中搜索化合物對應(yīng)的靶點，以UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/uniprot/)對收集的靶點進(jìn)行規(guī)范化和校正，得到成分相關(guān)的基因靶點。在MalaCards數(shù)據(jù)庫(https://www.malacards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(therapeutic targets database，http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)和OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中，輸入關(guān)鍵詞 “SARS(severe acute respiratory syndrome)”、“Respiratory Failure”，搜索已報道的與冠狀病毒感染相關(guān)的基因。剔除重復(fù)和假陽性基因后，建立冠狀病毒感染相關(guān)的靶點基因列表。

將獲得的化合物相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點以Venn工具(2.1.0，https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取靶點交集。將交集內(nèi)靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，以人類(Homosapiens)為種屬，查詢蛋白相互作用信息，從而構(gòu)建PPI(protein to protein interaction)網(wǎng)絡(luò)。整合PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白互作信息，“成分-疾病-靶點”及“中藥-成分”信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”預(yù)測網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊線來描述化合物與中藥、疾病和靶點之間的關(guān)系，以Cytoscape 的Network analysis插件分析并提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點和邊的特征。

1.1.3生物過程注釋及靶點的通路分析 為了分析止咳枇杷合劑的作用機制，采用R軟件包(3.6.2)的Cluster profiler包對交集靶點進(jìn)行GO(gene ontology)生物信息學(xué)富集分析，用3個本體(Ontology)描述基因靶點的分子功能(molecular function, MF)、所處的細(xì)胞位置(cellular component, CC)和參與的生物過程(biological process, BP)。然后以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫對靶點基因參與的主要生化代謝途徑進(jìn)行富集和注釋，顯著性差異設(shè)定卡值為P<0.05，采用ggplot2包對GO和KEGG通路富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2 枇杷止咳合劑抗2019-nCoV的活性化合物預(yù)測

1.2.1靶點與配體的預(yù)處理 以上海科技大學(xué)饒子和/楊海濤課題組公布的COVID-19 3CLpro高分辨率晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：6LU7)為對接模板，采用Schrodinger-2018軟件的Protein preparation wizard模塊對6LU7結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、去水、去雜原子等預(yù)處理。以6LU7原配體化合物為參照，以“1.1.1”項中篩選的活性成分為對接配體，采用Ligprep模塊對各成分結(jié)構(gòu)(*.sdf)進(jìn)行加氫等優(yōu)化預(yù)處理后生成批量處理文件。

1.2.2分子對接 以原始配體分子為中心，采用Receptor Grid Generation模塊生成格點文件(盒子大小設(shè)為14?)。以6LU7作為剛性受體，止咳枇杷合劑活性成分結(jié)構(gòu)作為構(gòu)象可變化(柔性)配體，進(jìn)行半柔性對接。

2 結(jié) 果

2.1 止咳枇杷合劑干預(yù)COVID-19的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1活性成分篩選 結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫和中國天然產(chǎn)物化學(xué)數(shù)據(jù)庫收載的止咳枇杷合劑組方中藥成分，基于樣本量、后續(xù)數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性以及研究價值的考慮，以口服生物利用度(OB)≥30%或類藥性(DL)≥0.18作為進(jìn)一步篩選條件，得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性化合物179個。

2.1.2“成分-疾病-靶點”篩選 通過TCMSP平臺數(shù)據(jù)庫中找到止咳枇杷合劑179個活性成分所對應(yīng)的靶點共322個，以Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索校正后生成“成分-靶點”集合。從MalaCards數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中得到關(guān)于冠狀病毒 “SARS”和“respiratory failure”相關(guān)的靶點共計144個，生成“疾病-靶點”集合。將上述得到的“成分-靶點”和“疾病-靶點”集合以Venn工具2.1.0取靶點交集，得到交集靶點30個(圖1A)。將交集內(nèi)靶點導(dǎo)入STRING 11.0，構(gòu)建蛋白與蛋白作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)(圖1B)。

圖1 止咳枇杷合劑中化學(xué)成分靶點與疾病網(wǎng)絡(luò)交集(A)及PPI網(wǎng)絡(luò)(B)Fig.1 Intersection network of the compounds and disease target of Zhikepipa Heji (A) and protein to protein interaction (B)

2.1.3“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將2.1.2項中篩選得到的30個疾病靶點與中藥進(jìn)行映射，篩選出34個核心化學(xué)成分，將6個中藥、34個成分及30個疾病靶點進(jìn)行映射并生成關(guān)聯(lián)表，與PPI網(wǎng)絡(luò)生成的互作表導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建止咳枇杷合劑的“中藥-化合物-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(圖2)，圖中共涉及70個節(jié)點，400個邊。不同顏色的圓點代表了止咳枇杷合劑中的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。分析6種中藥在網(wǎng)絡(luò)圖的連接度值可知，君藥枇杷葉度值最高(度值=48)，其次是百部(度值=22)，體現(xiàn)出君藥枇杷葉在整個復(fù)方中的重要作用。分析化學(xué)成分的連接度值，發(fā)現(xiàn)來自枇杷葉的活性成分槲皮素(MOL000098，quercetin)和芹菜素(MOL000008，apigenin)度值分別為42和12，其次是來自薄荷的(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[MOL006821，(-)-epigallocatechin-3-gallate]的度值為18，還有來自枇杷葉的成分蘆丁(MOL000415，rutin)和山奈酚(MOL000422，kaempferol)度值為10。由此可以看出，止咳枇杷合劑中治療疾病的主要活性成分為槲皮素、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芹菜素、蘆丁及山奈酚等。

圖2 止咳枇杷合劑中“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The target network diagram of the compounds of Zhikepipa Heji

橘色節(jié)點代表中藥，藍(lán)色節(jié)點代表活性成分，黃色節(jié)點代表疾病靶點。圖中節(jié)點大小代表度數(shù)大小，度數(shù)越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，接近中心度越大，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越接近中性。

通過對靶點連接點度值分析得出，排名前6位的靶點分別是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)(度值=30)、IL1B(度值=29)、IL6(度值=28)、IL10(度值=27)、CXCL8(度值=26)以及JUN(度值=25)。這說明止咳枇杷合劑可能主要通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫實現(xiàn)治療疾病的作用，此結(jié)果初步闡明“中藥-成分-靶點”的互作關(guān)系以及在整個復(fù)方中的定位。初步說明了止咳枇杷合劑治療疾病的多靶點、多途徑屬性，其中枇杷葉節(jié)點度數(shù)較大，說明其君藥的用藥合理性。此結(jié)果表明止咳枇杷合劑通過多成分、多靶點協(xié)同作用治療疾病。

2.1.4枇杷止咳合劑干預(yù)COVID-19的生物信息富集及代謝通路注釋 將“中藥-成分-疾病”網(wǎng)絡(luò)中篩選的對應(yīng)的30個靶點通過Cluster profiler進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋，共富集到GO條目2 789個，其中生物學(xué)過程(BP)2 504條，分子功能(CC)99條，細(xì)胞組成(MF)條目195條，分別占89.5%、3.5%、7%(圖3)。

圖3 止咳枇杷合劑作用靶點的GO分析富集圖Fig.3 GO enrichment analysis of the targets of Zhikepipa Heji

富集到KEGG信號通路282條(圖4)，這些靶點主要分布于細(xì)胞膜外(GO:0045121，membrane raft)、細(xì)胞膜微區(qū)(GO:0098857，membrane microdomain)、細(xì)胞膜區(qū)域(GO:0098589，membrane region)；其分子功能主要與細(xì)胞核受體活性(GO:0004879, nuclear receptor activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性(GO:0098531，transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性(GO:0008227，G protein-coupled amine receptor activity)有關(guān)；其生物學(xué)途徑(BP)主要涉及營養(yǎng)水平反應(yīng)(GO:0031667，response to nutrient levels)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(GO:0006979，response to oxidative stress)和脂多糖反應(yīng)(GO:0032496，response to lipopolysaccharide)。

圖4 止咳枇杷合劑KEGG富集分析圖Fig.4 Analysis of KEGG enrichment in 10 pathways as targets of Zhikepipa Heji

這些靶點主要調(diào)控的代謝通路為乙型肝炎(hsa05161, Hepatitis B)、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE通路(hsa04933, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、動脈粥樣硬化流體剪切力(hsa05418，fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號通路(hsa04657, IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(hsa04668，TNF signaling pathway)等。以上結(jié)果表明，止咳枇杷合劑中核心化合物可能通過干預(yù)環(huán)氧合酶1、IL1B、IL6、IL10、IL8等炎癥靶點，并作用于乙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE通路、IL-17信號通路及TNF信號通路等減輕病毒誘發(fā)的炎癥風(fēng)暴損傷和氧化應(yīng)激損傷，實現(xiàn)干預(yù)COVID-19患者的發(fā)熱咳嗽等癥狀。

2.2 止咳枇杷合劑中潛在2019-nCoV 3CLpro(PDB ID：6LU7)抑制劑的篩選將對接前后的6LU7原始配體進(jìn)行構(gòu)象疊合來驗證對接方法的準(zhǔn)確度，疊加結(jié)果顯示均方根偏差(RMSD)值為1.2813?<2?，說明該對接體系可以用于配體化合物與6LU7的對接。分子對接的打分值(docking score)絕對值越大說明配體-受體親和力越強，兩者結(jié)合越牢固。將“1.1.2”項中“中藥-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的34個化合物與6LU7體系(包括預(yù)處理受體和格點文件)進(jìn)行對接測試，以對接打分值絕對值高于6.0作為篩選條件。結(jié)果得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的化合物8個(表1)，大多數(shù)化合物為黃酮類化學(xué)物。

表1 止咳枇杷合劑中核心化合物與2019-nCoV 3CLpro(PDB ID：6LU7)對接的結(jié)合能力Tab.1 The combining activity of the core compounds from Zhikepipa Heji with 2019-nCoV 3CLpro

3 討 論

目前對COVID-19的治療仍缺乏特效藥物以及治療方案。臨床數(shù)據(jù)顯示，一些患者在短期內(nèi)出現(xiàn)多器官衰竭等導(dǎo)致死亡，并且有資料表明此現(xiàn)象可能與機體感染病毒后產(chǎn)生的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”有關(guān)[13-14]。中醫(yī)認(rèn)為COVID-19屬于“疫”病范疇，病因為感受“疫戾”之氣，主要傷及肺脾[15-16]，初期主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽。止咳枇杷合劑是臨床治療咳嗽的有效方劑，早期干預(yù)可能有效阻斷病情進(jìn)展、預(yù)防炎癥風(fēng)暴發(fā)生。

本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析了止咳枇杷合劑對COVID-19的潛在作用機制。首先通過TCMSP，查詢獲取止咳枇杷合劑中各個中藥的活性成分及其作用靶點，通過UniProt、GeneCards等數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應(yīng)的基因，然后構(gòu)建中藥活性成分-靶點進(jìn)行分析，找到止咳枇杷合劑的179個活性成分及其對應(yīng)的322個潛在作用靶點，同時與找到冠狀病毒“SARS”和“Respiratory Failure”相關(guān)的144個靶點，再與止咳枇杷合劑活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交集分析，初步篩選出止咳枇杷合劑核心活性成分共34個，包括槲皮素、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、山奈酚、芹菜素等，以及對應(yīng)的疾病靶點30個。

細(xì)胞因子和炎癥趨化因子在病毒感染疾病的免疫應(yīng)答及免疫病理損傷中有非常重要的作用[17-18]，已證實中醫(yī)藥在防治炎癥因子風(fēng)暴方面獨具優(yōu)勢[19-20]。當(dāng)病毒入侵機體后，通過上呼吸道進(jìn)入支氣管和肺泡，機體在受到病毒感染后會激發(fā)自身免疫應(yīng)答。文獻(xiàn)已證實，冠狀病毒感染后會在體內(nèi)誘發(fā)異常的炎癥因子風(fēng)暴，導(dǎo)致機體組織器官的炎癥損傷[21]。因此，抑制COVID-19中炎癥因子的產(chǎn)生是藥物治療的主要目標(biāo)之一。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析活性成分作用的主要疾病靶點為與炎癥免疫密切相關(guān)的靶點，尤其是IL1B、IL6、IL10、CXCL8靶點相關(guān)的且排名前6位的通路，發(fā)現(xiàn)止咳枇杷合劑的活性成分對炎癥細(xì)胞因子通路如乙型肝炎信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子通路等具有較強的作用，推測止咳枇杷合劑可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路抑制炎癥因子風(fēng)暴，起到消炎止咳的作用。已有多個研究證實了2019-nCoV 3CLpro水解酶可以作為抗病毒藥物靶標(biāo)篩選的重要蛋白[22]。為了更好揭示止咳枇杷合劑中的核心活性成分，本研究利用分子對接技術(shù)研究了核心活性成分對2019-nCoV 3CLpro水解酶的抑制作用。一般認(rèn)為打分值(docking score)絕對值大于5.0則表明分子與靶點有較好的結(jié)合活性，大于7.0則說明具有強烈的結(jié)合活性[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，止咳枇杷合劑中的核心化合物柚皮素、蘆丁、芹菜素及山奈酚的打分值絕對值大于7，表明止咳枇杷合劑中的核心化學(xué)成分具有潛在的抗病毒活性。

綜上所述，本研究對止咳枇杷合劑干預(yù)COVID-19的活性成分、靶點及通路進(jìn)行了探索性研究，并篩選了其抗2019-nCoV的活性成分。結(jié)果初步表明，止咳枇杷合劑中枇杷葉和百部是“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中的重點中藥，其黃酮類成分如柚皮素、蘆丁、芹菜素等是其抗炎、抗病毒的主要成分。綜合代謝通路注釋結(jié)果說明止咳枇杷合劑可通過多成分、多靶點、多通路干預(yù)疾病的特點。雖然有研究顯示COVID-19的基因組與“SARS”的同源性高達(dá)79%[24]，且其主要臨床癥狀為呼吸系統(tǒng)障礙[25]。但是從目前COVID-19全球傳播，且防治難度大的現(xiàn)實分析，通過“SARS”和“Respiratory Failure”為主要靶點預(yù)測藥物抗COVID-19的靶點存在一定的局限性。本研究結(jié)果僅初步預(yù)測止咳枇杷合劑抗COVID-19的潛在作用機制及活性成分。因此，本課題組將持續(xù)開展評價物質(zhì)基礎(chǔ)-藥效學(xué)-代謝組學(xué)-分子機制驗證等實驗研究，為止咳枇杷合劑治療COVID-19提供理論基礎(chǔ)。